Deep sequencing artificially inflates estimates of microbial diversity

Um die unsichtbare Welt zu verstehen, die auf unserer Haut, in unserem Boden oder in unserem Darm lebt, greifen Wissenschaftler oft auf eine Technik zurück, die wie eine genetische Volkszählung wirkt. Sie nehmen eine Probe, isolieren die DNA der vorhandenen winzigen Organismen und nutzen Maschinen, um den genetischen Code spezifischer Gene zu lesen, die als eindeutige Identifikatoren für jede Art dienen. Indem sie zählen, wie viele verschiedene Versionen dieser Gene in einer Probe vorkommen, können Forscher abschätzen, wie viele verschiedene Arten von Mikroben dort leben. Diese Methode hat unseren Blick auf die mikrobielle Welt revolutioniert und komplexe Gemeinschaften enthüllt, die zuvor unsichtbar waren. Damit diese Zählungen jedoch aussagekräftig sind, müssen die Daten die Realität widerspiegeln und nicht die Eigenheiten der Maschine, die zählt. Wenn die Technologie selbst die Illusion neuen Lebens erzeugt, wo keines existiert, wird das gesamte Bild der mikrobiellen Vielfalt verzerrt, was Wissenschaftler zu der Annahme führt, eine Gemeinschaft sei weitaus vielfältiger, als sie es tatsächlich ist.

Eine aktuelle Studie befasst sich mit einem beunruhigenden Muster, bei dem der bloße Akt des tieferen Blickens in eine Probe scheinbar mehr Leben erschafft, als tatsächlich vorhanden ist. Die Forscher begannen damit, ein einfaches, kontrolliertes Szenario zu testen: Sie nahmen Proben, die nur einen einzigen Typ einer genetischen Sequenz enthielten, was bedeutete, dass von vornherein null Diversität vorhanden war. Diese „Null-Diversitäts“-Proben wurden unter Verwendung von Wirtsgenen erstellt, die sich kaum verändern, oder durch das Hinzufügen synthetischer DNA-Stränge zur Mischung. Als diese einheitlichen Proben sequenziert wurden, waren die Ergebnisse erschreckend. Anstatt nur einen Typ einer Sequenz zu sehen, meldeten die Maschinen hunderte verschiedener Varianten. Das Problem verschärfte sich, als die Forscher die Anzahl der Reads, also das gesamte Volumen der gesammelten Daten, erhöhten. Sobald die Sequenzierung einhunderttausend Reads überschritt, explodierte die Zahl der falschen Varianten exponentiell. Es schien, als würde die Maschine aus dem Nichts neue Arten erfinden, einfach nur, weil sie so intensiv und so lange hinsah.

Diese künstliche Inflation beschränkte sich nicht auf die kontrollierten Reagenzgläser. Als die Forscher dieselbe Analyse auf echte mikrobielle Proben anwandten, wie etwa solche, die Bakterien oder Pilze enthalten, fanden sie dasselbe Muster. Mit zunehmender Anzahl der Reads stieg die berechnete Diversität der Gemeinschaft an, selbst wenn die tatsächliche biologische Zusammensetzung der Probe unverändert blieb. Die Studie zeigte, dass dieser Fehler nicht nur die Gesamtzahl der Arten betraf, sondern auch die wahrgenommene Vielfalt innerhalb spezifischer Gruppen von Organismen. Die Forscher fanden heraus, dass dieses Problem konsistent über verschiedene Arten von genetischen Markern auftrat, die zur Identifizierung von Mikroben verwendet werden, was auf eine grundlegende Herausforderung in der Art und Weise hindeutet, wie aktuelle Sequenzierungstechnologien mit großen Datenvolumina umgehen.

Das Team untersuchte, ob spezifische Anpassungen das Problem lösen könnten. Sie testeten die Verkürzung der Länge der von der Maschine gelesenen Gensequenzen und versuchten es mit einer anderen Sequenzierungsplattform, der AVITI Element. Obwohl diese Änderungen halfen, die Anzahl der falschen Varianten zu reduzieren, konnten sie das Problem nicht vollständig beseitigen. Die künstliche Inflation blieb bestehen, wenn auch in abgeschwächter Form. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass die derzeit praktischste Lösung darin besteht, äußerst vorsichtig beim Vergleich von Proben zu sein, die mit sehr unterschiedlicher Tiefe sequenziert wurden. Wenn eine Probe eine Million Mal gelesen wurde und eine andere nur tausend Mal, wird die erste mit Sicherheit vielfältiger erscheinen – nicht weil sie es ist, sondern weil die Maschine mehr Gelegenheiten hatte, Fehler zu generieren. Die Studie legt nahe, dass die Verwendung dieser kontrollierten Null-Diversitäts-Proben als Referenzwert Wissenschaftlern helfen kann, ihre Methoden so abzustimmen, dass sie der Wahrheit näher kommen und sicherstellen, dass die Karten der mikrobiellen Welt, die sie zeichnen, auf dem basieren, was tatsächlich vorhanden ist, und nicht auf dem, was die Maschine sich vorstellt.