Deep sequencing artificially inflates estimates of microbial diversity

Para comprender el mundo invisible que habita en nuestra piel, en nuestro suelo o dentro de nuestro intestino, los científicos recurren a menudo a una técnica que actúa como un censo genético. Toman una muestra, aíslan el ADN de los diminutos organismos presentes y utilizan máquinas para leer el código genético de genes específicos que actúan como identificadores únicos para cada especie. Al contar cuántas versiones diferentes de estos genes aparecen en una muestra, los investigadores pueden estimar cuántos tipos diferentes de microbios viven allí. Este método ha revolucionado nuestra visión del mundo microbiano, revelando comunidades complejas que antes eran invisibles. Sin embargo, para que estos recuentos sean significativos, los datos deben reflejar la realidad, no las peculiaridades de la máquina que realiza el conteo. Si la tecnología en sí misma crea la ilusión de nueva vida donde no existe, la imagen completa de la diversidad microbiana se distorsiona, llevando a los científicos a creer que una comunidad es mucho más variada de lo que realmente es.

Un estudio reciente aborda un patrón preocupante en el que el mero acto de mirar más profundamente en una muestra parece crear más vida de la que realmente hay. Los investigadores comenzaron probando un escenario simple y controlado: tomaron muestras que contenían un solo tipo de secuencia genética, lo que significaba que había cero diversidad desde el principio. Estas muestras de "cero diversidad" se crearon utilizando genes del huésped que no varían mucho o utilizando cadenas sintéticas de ADN añadidas a la mezcla. Cuando estas muestras uniformes fueron secuenciadas, los resultados fueron sorprendentes. En lugar de ver solo un tipo de secuencia, las máquinas reportaron cientos de variantes diferentes. El problema empeoró a medida que los investigadores aumentaban el número de lecturas, o el volumen total de datos recolectados. Una vez que la secuenciación superó las cien mil lecturas, el número de variantes falsas explotó exponencialmente. Parecía como si la máquina estuviera inventando nuevas especies de la nada, simplemente porque estaba mirando con tanta intensidad y durante tanto tiempo.

Esta inflación artificial no se limitó a los tubos de ensayo controlados. Cuando los investigadores aplicaron el mismo análisis a muestras microbianas reales, como aquellas que contienen bacterias u hongos, encontraron el mismo patrón. A medida que aumentaba el número de lecturas, la diversidad calculada de la comunidad aumentaba, incluso cuando la composición biológica real de la muestra permanecía inalterada. El estudio mostró que este error afectaba no solo al recuento total de especies, sino también a la variedad percibida dentro de grupos específicos de organismos. Los investigadores encontraron que este problema era constante en los diferentes tipos de marcadores genéticos utilizados para identificar microbios, lo que sugiere un desafío fundamental en la forma en que las tecnologías de secuenciación actuales manejan grandes volúmenes de datos.

El equipo investigó si ajustes específicos podrían solucionar el problema. Probaron acortar la longitud de las secuencias genéticas leídas por la máquina e intentaron utilizar una plataforma de secuenciación diferente conocida como AVITI Element. Si bien estos cambios ayudaron a reducir el número de variantes falsas, no eliminaron el problema por completo. La inflación artificial persistió, aunque de forma menor. Los autores concluyen que la solución más práctica por ahora es ser extremadamente cuidadosos al comparar muestras que han sido secuenciadas con profundidades muy diferentes. Si una muestra ha sido leída un millón de veces y otra solo mil veces, la primera aparecerá casi con seguridad más diversa, no porque lo sea, sino porque la máquina ha tenido más oportunidades de generar errores. El estudio sugiere que el uso de estas muestras controladas de cero diversidad como punto de referencia puede ayudar a los científicos a ajustar sus métodos para acercarse a la verdad, asegurando que los mapas del mundo microbiano que dibujan se basen en lo que realmente está ahí, y no en lo que la máquina imagina.