Plunge freezing tweezers with ultrasonic excitation for reducing preferred particle orientation in cryo-EM
Questo articolo presenta una nuova tecnica di congelamento per immersione che integra un trasduttore ultrasonico nelle pinzette per distaccare le proteine dall'interfaccia aria-acqua, mitigando così i problemi di orientamento preferenziale e consentendo ricostruzioni ad alta risoluzione di 2,5 Å di campioni difficili come l'emagglutinina.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Per vedere la macchina della vita in azione, gli scienziati si rivolgono spesso a una tecnica chiamata criomicroscopia elettronica. Il processo consiste nel prendere una minuscola goccia di liquido contenente proteine, congelandola così rapidamente che l'acqua si trasforma in vetro anziché in cristalli di ghiaccio, e poi sparando un fascio di elettroni attraverso di essa per creare un'immagine dettagliata. Poiché queste proteine sono troppo piccole per essere viste chiaramente da un solo angolo, i ricercatori devono catturare migliaia di immagini da diverse direzioni e cucirle insieme in un modello tridimensionale. Tuttavia, un problema persistente ha a lungo tormentato questo metodo: quando la goccia di liquido viene preparata, le proteine spesso aderiscono alla superficie dove l'aria incontra l'acqua. Proprio come un pezzo di carta che galleggia su uno stagno tende a posarsi piatto, queste proteine si allineano in un'unica orientazione piatta contro quella superficie. Quando vengono congelate, rimangono tutte bloccate rivolte nella stessa direzione, lasciando gli scienziati con un mucchio di viste identiche e perdendo gli angoli laterali cruciali necessari per costruire un quadro completo. Senza questi angoli mancanti, il modello 3D finale rimane sfocato, incompleto o talvolta impossibile da costruire del tutto.
Un team di ricercatori dell'Istituto Federale Svizzero di Tecnologia di Losanna ha sviluppato una soluzione meccanica a questo problema di adesione, una che scuote il campione quel tanto che basta per lasciare che le proteine fluttuino liberamente prima di congelarsi. Hanno modificato lo strumento standard utilizzato per tenere il campione — un paio di pinzette metalliche — inserendo un piccolo dispositivo all'interno del manico che vibra a una velocità estremamente elevata. Quando gli scienziati immergono il campione nel liquido congelante, attivano questa vibrazione. Il movimento di scuotimento si propaga attraverso le pinzette metalliche nel sottile film di liquido che contiene le proteine, creando un'agitazione delicata che distacca le particelle dalla superficie aria-acqua. Ciò permette alle proteine di rotolare e ruotare, adottando una vasta gamma di angoli prima che il liquido si solidifichi. Testando questo metodo su una specifica proteina nota per la sua ostinata tendenza a sdraiarsi piatta, il team ha dimostato che la vibrazione ha rimescolato con successo le orientazioni, consentendo loro di costruire un modello 3D nitido e completo che era precedentemente irraggiungibile.
I ricercatori hanno concentrato i loro sforzi su una proteina chiamata emagglutinina, che è un classico esempio del problema di orientamento. Nelle preparazioni standard senza vibrazione, la proteina si assesta prevalentemente con la parte superiore o inferiore rivolta verso il fascio di elettroni, lasciando le viste laterali quasi completamente assenti. Quando il team ha applicato le loro pinzette vibranti, i risultati sono cambiati drasticamente. A livelli di vibrazione più bassi, hanno iniziato a vedere più viste laterali, ma la distribuzione era ancora irregolare. Man mano che aumentavano l'intensità della vibrazione, le proteine diventavano molto più equamente distribuite tra tutti i possibili angoli. L'impostazione di maggior successo ha permesso loro di catturare una gamma completa di viste, inclusi i rari prospetti laterali e inclinati che erano stati precedentemente mancanti. Questo traguardo ha permesso loro di ricostruire l'intera struttura del trimero proteico con una risoluzione di 2,5 angstrom, un livello di dettaglio abbastanza nitido da vedere gli atomi individuali. Al contrario, il metodo standard senza vibrazione produceva una mappa troncata e incompleta che non poteva essere pienamente risolta.
Il dispositivo stesso è progettato per essere semplice e non invasivo, adattandosi alle attrezzature di laboratorio esistenti senza richiedere modifiche permanenti. La componente vibrante è integrata in un supporto personalizzato che tiene le pinzette, e un sottile cavo passa attraverso un sistema di piccole ruote per alimentare la vibrazione senza aggrovigliarsi durante il processo di congelamento. Il team ha scoperto che la vibrazione doveva essere temporizzata con cura, iniziando appena prima che il campione toccasse il liquido congelante e continuando per un breve periodo. Hanno testato il metodo anche su altre proteine, inclusa una coinvolta nella risposta immunitaria e una grande componente del macchinario cellulare di sintesi proteica. Sebbene i risultati variassero leggermente a seconda della proteina, la vibrazione aiutava costantemente a rompere l'orientamento preferenziale, dimostrando che lo scuotimento meccanico è un modo praticabile per migliorare la qualità di queste immagini microscopiche. I ricercatori suggeriscono che questo approccio potrebbe essere combinato con altre tecniche per migliorare ulteriormente la chiarezza delle strutture biologiche, offrendo un nuovo strumento agli scienziati che hanno bisogno di vedere la forma completa delle molecole che guidano la vita.
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