Plunge freezing tweezers with ultrasonic excitation for reducing preferred particle orientation in cryo-EM
Dit artikel presenteert een nieuwe plunge-freezing techniek die een ultrasone transducer in de pincet integreert om eiwitten van de lucht-waterinterface te verwijderen, waardoor problemen met voorkeursoriëntatie worden verminderd en hoogresolutie 2,5 Å reconstructies van uitdagende monsters zoals hemagglutinine mogelijk worden gemaakt.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Om de machinerie van het leven in actie te zien, wenden wetenschappers zich vaak tot een techniek genaamd cryo-elektronenmicroscopie. Het proces houdt in dat er een minuscuul druppeltje vloeistof die eiwitten bevat wordt genomen, dat zo snel wordt bevroren dat het water in glas verandert in plaats van in ijskristallen, en dat er vervolgens een bundel elektronen doorheen wordt geschoten om een gedetailleerde afbeelding te creëren. Omdat deze eiwitten te klein zijn om duidelijk vanuit slechts één hoek te worden gezien, moeten onderzoekers duizenden afbeeldingen vanuit verschillende richtingen vastleggen en deze aan elkaar naaien tot een driedimensionaal model. Een hardnekkig probleem heeft deze methode echter lang geplaagd: wanneer de vloeibare druppel wordt voorbereid, plakken de eiwitten vaak aan het oppervlak waar de lucht de waterkant ontmoet. Net zoals een stuk papier dat op een vijver drijft de neiging heeft om plat te gaan liggen, lijnen deze eiwitten zichzelf uit in een enkele, platte oriëntatie tegen dat oppervlak. Wanneer ze bevroren zijn, zitten ze allemaal op dezelfde manier vast, waardoor wetenschappers achterblijven met een stapel identieke aanzichten en de cruciale zijwaartse hoeken missen die nodig zijn om een compleet beeld te bouwen. Zonder deze ontbrekende hoeken blijft het uiteindelijke 3D-model wazig, incompleet of soms zelfs onmogelijk te construeren.
Een team onderzoekers aan het School Federal Institute of Technology in Lausanne heeft een mechanische oplossing ontwikkeld voor dit plakprobleem, een oplossing die het monster net genoeg laat schudden zodat de eiwitten vrij kunnen blijven drijven voordat ze bevriezen. Ze hebben het standaardinstrument dat wordt gebruikt om het monster vast te houden — een paar metalen pincetten — aangepast door een klein apparaat in de handgreep in te bedden dat met een extreem hoge snelheid vibreert. Wanneer de wetenschappers het monster in de bevriezende vloeistof dompelen, activeren ze deze vibratie. De schuddende beweging verplaatst zich door de metalen pincetten naar de dunne film van vloeistof die de eiwitten vasthoudt, wat een milde agitatie creëert die de deeltjes losmaakt van het lucht-wateroppervlak. Dit stelt de eiwitten in staat om te tollen en te draaien, waardoor ze een breed scala aan hoeken aannemen voordat de vloeistof stolt. Door deze methode te testen op een specifiek eiwit dat bekend staat om zijn koppige neiging om plat te liggen, toonde het team aan dat de vibratie de oriëntaties succesvol door elkaar heeft gehusseld, wat hen in staat stelde een scherp, compleet 3D-model te bouwen dat voorheen onbereikbaar was.
De onderzoekers richtten hun inspanningen op een eiwit genaamd hemagglutinine, wat een klassiek voorbeeld is van het oriëntatieprobleem. In standaardpreparaties zonder vibratie nestelt het eiwit zich overweldigend met de boven- of onderkant gericht naar de elektronenbundel, waardoor de zijwaartse aanzichten bijna volledig ontbreken. Wanneer het team hun vibrerende pincetten toepaste, veranderden de resultaten drastisch. Bij lagere niveaus van vibratie begonnen ze meer zijwaartse aanzichten te zien, maar de verdeling was nog steeds ongelijkmatig. Naarmate ze de kracht van de vibratie verhoogden, werden de eiwitten veel gelijkmatiger verdeeld over alle mogelijke hoeken. De meest succesvolle instelling stelde hen in staat om een volledig bereik aan aanzichten vast te leggen, inclusief de zeldzame zijwaartse en gekantelde perspectieven die voorheen ontbraken. Deze doorbraak stelde hen in staat om de volledige structuur van het eiwittrimeer te reconstrueren met een resolutie van 2,5 ångström, een detailniveau dat scherp genoeg is om individuele atomen te zien. In contrast hiermee produceerde de standaardmethode zonder vibratie een afgekapte, incomplete kaart die niet volledig kon worden opgelost.
Het apparaat zelf is ontworpen om eenvoudig en niet-invasief te zijn, passend op bestaande laboratoriumapparatuur zonder dat permanente wijzigingen nodig zijn. De vibrerende component is ingebouwd in een aangepaste houder die de pincetten vasthoudt, en een dunne kabel loopt via een systeem van kleine wieltjes om de vibratie van stroom te voorzien zonder dat deze tijdens het bevriezingsproces in de knoop raakt. Het team kwam tot de conclusie dat de vibratie zorgvuldig getimed moest worden, beginnend vlak voordat het monster de bevriezende vloeistof raakte en voortduurend gedurende een korte periode. Ze testten de methode ook op andere eiwitten, waaronder één die betrokken is bij de immuunrespons en een grote component van de eiwitmakende machinerie van de cel. Hoewel de resultaten enigszins varieerden afhankelijk van het eiwit, hielp de vibratie consequent om de voorkeursoriëntatie te doorbreken, wat bewees dat mechanisch schudden een levensvatbare manier is om de kwaliteit van deze microscopische beelden te verbeteren. De onderzoekers suggereren dat deze aanpak gecombineerd kan worden met andere technieken om de helderheid van biologische structuren verder te verbeteren, waarmee een nieuw instrument wordt geboden aan wetenschappers die de volledige vorm van de moleculen die het leven aandrijven, willen zien.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.