Plunge freezing tweezers with ultrasonic excitation for reducing preferred particle orientation in cryo-EM
本論文は、タンパク質を気液界面から剥離させるために超音波トランスデューサーをピンセットに統合した新しいプランジ凍結技術を提示しており、それによって優先配向の問題を軽減し、ヘマグルチニンのような困難な試料の2.5 Åという高分解能な再構成を可能にしている。
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生命の仕組みが動いている様子を見るために、科学者たちはしばしばクライオ電子顕微鏡と呼ばれる技術を用いる。そのプロセスは、タンパク質を含む微量の液体滴を取り、水が氷の結晶ではなくガラス状になるほど急速に凍結させ、その後、電子線を発射して詳細な画像を作成するというものである。これらのタンパク質はあまりに小さいため、一つの角度からだけでは鮮明に見ることができないため、研究者は異なる方向から数千枚の画像を撮影し、それらを繋ぎ合わせて三次元モデルを作成しなければならない。しかし、この手法には長年、ある執拗な問題がつきまとってきた。それは、液体の滴を準備する際、タンパク質が空気と水が接する表面に付着してしまうことである。池に浮かぶ紙切れが平らに落ち着こうとするのと同様に、これらのタンパク質は、その表面に対して単一の平坦な向きに整列してしまう。凍結されるとき、それらはすべて同じ方向を向いたまま固まってしまい、科学者たちには同一の視点ばかりが積み重なり、完全な図を構築するために不可欠な側面からの角度が欠落してしまうのである。これらの欠けている角度がなければ、最終的な3Dモデルはぼやけたり、不完全になったり、あるいは時には構築自体が不可能になったりする。
スイス連邦工科大学ローザンヌ校の研究チームは、この付着問題に対して、凍結する前にタンパク質が自由に浮遊できるように、サンプルをちょうど良い程度に揺らすという機械的な解決策を開発した。彼らは、サンプルの保持に使用される標準的な道具である金属製のピンセットを改良し、そのハンドル部分に超高速で振動する小さな装置を組み込んだ。科学者がサンプルを凍結液に浸す際、この振動を作動させる。この揺れの動きは金属製のピンセットを通じて、タンパク質を保持している薄い液膜へと伝わり、粒子を表面から引き離す穏やかな攪拌を生み出す。これにより、タンパク質は液体が固まる前に、さまざまな角度で回転し、転がるようになる。この手法を、平らに横たわる頑固な傾向があることで知られる特定のタンパク質を用いてテストしたところ、研究チームは、振動によって向きがうまく混ざり合い、以前は到達不可能であった鮮明で完全な3Dモデルの構築が可能になったことを実証した。
研究者たちは、ヘマグルチニンと呼ばれるタンパク質に注力した。これは、向きの問題の典型的な例である。振動のない標準的な調製法では、タンパク質は圧倒的に、その上部または下部を電子線に向けて落ち着いてしまい、側面からの視点がほとんど完全に欠落してしまう。チームが振動するピンセットを適用したところ、結果は劇的に変化した。振動のレベルが低い段階では、より多くの側面が見え始めたが、分布はまだ偏っていた。振動の強さを増していくにつれて、タンパク質はあらゆる可能な角度に対してより均一に分布するようになった。最も成功した設定では、これまで欠けていた希少な側面や傾いた視点を含む、全範囲のビューを捉えることができた。この突破口により、研究チームはタンパク質三量体の全構造を、個々の原子が見えるほど詳細な2.5オングストロームの解像度で再構成することができた。対照的に、振動なしの標準的な手法では、完全には解像できない、切り取られた不完全なマップが生成された。
装置自体はシンプルかつ非侵襲的に設計されており、恒久的な変更を必要とせずに既存の実験機器に取り付けることができる。振動コンポーネントはピンセットを保持するカスタムマウントに組み込まれており、細いケーブルが小さなホイールのシステムを通って、凍結プロセス中に絡まることなく振動を供給する。チームは、振動を開始するタイミングを慎重に調整する必要があり、サンプルが凍結液に触れる直前から開始し、短時間継続させる必要があることを見出した。彼らは、免疫反応に関与するものや、細胞のタンパク質合成機構の大きな構成要素を含む他のタンパク質についてもこの手法をテストした。結果はタンパク質によって多少異なったものの、振動は一貫して好ましい向きを打破するのに役立ち、機械的な揺動が顕微鏡画像の品質を向上させる有効な方法であることを証明した。研究者たちは、このアプローチが他の技術と組み合わされることで生物学的構造の明瞭さをさらに高めることができ、生命を駆動する分子の完全な形状を見ようとする科学者たちに新たなツールを提供できると考えている。
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