Plunge freezing tweezers with ultrasonic excitation for reducing preferred particle orientation in cryo-EM
本文提出了一种新型的非骤冷冻技术，该技术通过在镊子中集成超声换能器以使蛋白质从气液界面脱离，从而缓解了择优取向问题，并实现了对如血凝素等挑战性样本的高分辨率 2.5 Å 重建。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
为了观察生命机制的运作，科学家们经常转向一种被称为冷冻电子显微镜的技术。这一过程包括取一滴含有蛋白质的微小液体滴，通过极速冷冻使其变成玻璃态而非冰晶，然后发射电子束穿过它以创建详细的图像。由于这些蛋白质太小，无法仅从一个角度清晰观察，研究人员必须捕捉来自不同方向的数千张图像，并将它们缝合在一起，构建成一个三维模型。然而，一个长期困扰该方法的问题在于：在准备液体滴时，蛋白质往往会粘附在空气与水接触的表面。就像漂浮在池塘上的纸片倾向于平铺在水面上一样，这些蛋白质也会在那个表面上排列成单一且扁平的方向。当被冻结时，它们全都以相同的方式面向观察者，导致科学家只得到一堆完全相同的视角，从而缺失了构建完整图像所需的关键侧面角度。由于缺少这些角度，最终的三维模型会变得模糊、不完整，甚至有时根本无法构建。
瑞士洛桑联邦理工学院的一支研究小组开发了一种针对这种粘附问题的机械解决方案，即通过适度摇晃样本，让蛋白质在冻结前能够自由漂浮。他们改进了用于固定样本的标准工具——一把金属镊子——在手柄内部嵌入了一个能以极高速度振动的小装置。当科学家将样本浸入冷冻液体时，他们会启动这种振动。震动通过金属镊子传递到持有蛋白质的薄液膜中，产生一种轻微的搅动，使颗粒从气液界面脱离。这使得蛋白质能够在液体凝固前发生翻转和旋转，从而采取多种多样的角度。通过在一种以“爱躺平”著称的特定蛋白质上测试这种方法，团队证明了振动成功地打乱了取向，使他们能够构建出一个此前无法获得的清晰、完整的三维模型。
研究人员将精力集中在一种名为血凝素（hemagglutinin）的蛋白质上，它是取向问题的一个典型案例。在没有振动的标准制备过程中，该蛋白质绝大多数情况下会以其顶部或底部面向电子束，导致侧视图几乎完全缺失。当团队使用振动镊子时，结果发生了戏剧性的变化。在较低水平的振动下，他们开始看到更多的侧视图，但分布仍然不均匀。随着他们增加振动强度，蛋白质在所有可能角度上的分布变得更加均匀。最成功的设置使他们能够捕捉到全范围的视图，包括此前一直缺失的罕见侧向和倾斜视角。这一突破使他们能够重建出分辨率达2.5埃的蛋白质三聚体完整结构，这一细节水平足以看清单个原子。相比之下，不带振动的标准方法产生的图像是一个截断的、不完整的图谱，无法实现完全解析。
该装置设计简单且具有非侵入性，可以安装在现有的实验室设备上，无需进行永久性改动。振动组件内置于一个固定镊子的定制支架中，一根细电缆通过一套小轮系统运行，以确保在冻结过程中为振动供电且不会缠绕。团队发现，振动需要经过仔细的定时，即在样本接触冷冻液体之前开始，并持续一小段时间。他们还在其他蛋白质上测试了这种方法，包括一种参与免疫反应的蛋白质以及细胞蛋白质合成机制中的一个大型组成部分。虽然结果因蛋白质而略有差异，但振动一致地有助于打破这种偏好取向，证明了机械摇晃是提高这些显微图像质量的一种可行方法。研究人员建议，这种方法可以与其他技术结合使用，以进一步增强生物结构的清晰度，为需要观察驱动生命的分子完整形状的科学家们提供一种新工具。
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