Plunge freezing tweezers with ultrasonic excitation for reducing preferred particle orientation in cryo-EM
Diese Arbeit präsentiert eine neuartige Plunge-Freezing-Technik, die einen Ultraschallwandler in die Pinzette integriert, um Proteine von der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen, wodurch Probleme mit bevorzugter Orientierung gemildert und hochauflösende 2,5 Å Rekonstruktionen anspruchsvoller Proben wie Hämagglutinin ermöglicht werden.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Um die Maschinerie des Lebens in Aktion zu sehen, greifen Wissenschaftler oft auf eine Technik namens Kryo-Elektronenmikroskopie zurück. Der Prozess beinhaltet das Aufnehmen eines winzigen Tropfens einer Flüssigkeit, die Proteine enthält, das schnelle Einfrieren, sodass das Wasser zu Glas statt zu Eiskristallen wird, und das anschließende Durchschießen mit einem Elektronenstrahl, um ein detailliertes Bild zu erzeugen. Da diese Proteine zu klein sind, um aus nur einem Winkel klar gesehen zu werden, müssen Forscher tausende Bilder aus verschiedenen Richtungen aufnehmen und diese zu einem dreidimensionalen Modell zusammenfügen. Ein hartnäckiges Problem plagt diese Methode jedoch schon lange: Bei der Vorbereitung des Flüssigkeitstropfens haften die Proteine oft an der Oberfläche, an der Luft auf Wasser trifft. Ähnlich wie ein Stück Papier, das auf einem Teich treibt und dazu neigt, flach zu liegen, richten sich diese Proteine in einer einzigen, flachen Orientierung gegen diese Oberfläche aus. Beim Einfrieren sind sie alle in die gleiche Richtung fixiert, was die Wissenschaftler mit einem Haufen identischer Ansichten zurücklässt und die entscheidenden Seitenwinkel fehlen lässt, die für den Aufbau eines vollständigen Bildes nötig sind. Ohne diese fehlenden Winkel bleibt das endgültige 3D-Modell verschwommen, unvollständig oder ist manchmal gar nicht erst konstruierbar.
Ein Forschungsteam am Eidgenössischen Technischen Institut der Hochschule Lausanne hat eine mechanische Lösung für dieses Haftungsproblem entwickelt – eine, welche die Probe gerade so weit schüttelt, dass die Proteine frei schweben können, bevor sie gefrieren. Sie modifizierten das Standardwerkzeug, das zur Halterung der Probe verwendet wird – eine Metallpinzette –, indem sie ein kleines Gerät im Griff einbetteten, das mit extrem hoher Geschwindigkeit vibriert. Wenn die Wissenschaftler die Probe in die gefrierende Flüssigkeit eintauchen, aktivieren sie diese Vibration. Die Schüttelbewegung überträgt sich durch die Metallpinzette auf den dünnen Flüssigkeitsfilm, der die Proteine hält, und erzeugt eine sanfte Agitation, die die Partikel von der Luft-Wasser-Oberfläche ablöst. Dies ermöglicht es den Proteinen, zu trudeln und zu rotieren, wodurch sie vor der Verfestigung der Flüssigkeit eine Vielzahl von Winkeln einnehmen. Durch das Testen dieser Methode an einem spezifischen Protein, das für seine hartnäckige Tendenz bekannt ist, flach zu liegen, demonstrierte das Team, dass die Vibration die Orientierungen erfolgreich durchmischte und es ihnen ermöglichte, ein scharfes, vollständiges 3D-Modell zu erstellen, das zuvor unerreichbar war.
Die Forscher konzentrierten ihre Bemühungen auf ein Protein namens Hämagglutinin, ein klassisches Beispiel für das Orientierungsproblem. In Standardpräparationen ohne Vibration setzt sich das Protein überwiegend so ab, dass seine Ober- oder Unterseite dem Elektronenstrahl zugewandt ist, wodurch die Seitenansichten fast vollständig fehlen. Als das Team ihre vibrierenden Pinzetten anwandte, änderten sich die Ergebnisse dramatisch. Bei niedrigeren Vibrationsstufen begannen sie, mehr Seitenansichten zu sehen, aber die Verteilung war immer noch ungleichmäßig. Als sie die Stärke der Vibration erhöhten, verteilten sich die Proteine viel gleichmäßiger über alle möglichen Winkel. Die erfolgreichste Einstellung erlaubte es ihnen, ein volles Spektrum an Ansichten zu erfassen, einschließlich der seltenen Seiten- und geneigten Perspektiven, die zuvor gefehlt hatten. Dieser Durchbruch ermöglichte es ihnen, die gesamte Struktur des Protein-Trimers mit einer Auflösung von 2,5 Angström zu rekonstruieren – ein Detailgrad, der scharf genug ist, um einzelne Atome zu sehen. Im Gegensatz dazu lieferte die Standardmethode ohne Vibration eine verkürzte, unvollständige Karte, die nicht vollständig aufgelöst werden konnte.
Das Gerät selbst ist so konzipiert, dass es einfach und nicht-invasiv ist und ohne dauerhafte Änderungen an bestehende Laborgeräte angepasst werden kann. Die vibrierende Komponente ist in eine maßgeschneiderte Halterung eingebaut, die die Pinzette hält, und ein dünnes Kabel führt durch ein System kleiner Räder, um die Vibration anzutreiben, ohne sich während des Gefriervorgangs zu verheddern. Das Team stellte fest, dass die Vibration sorgfältig zeitlich abgestimmt werden musste, indem sie kurz vor dem Auftreffen der Probe auf die gefrierende Flüssigkeit startete und für eine kurze Zeit anhielt. Sie testeten die Methode auch an anderen Proteinen, darunter eines, das an der Immunantwort beteiligt ist, sowie einem großen Bestandteil der Protein-Synthese-Maschinerie der Zelle. Obwohl die Ergebnisse je nach Protein leicht variierten, half die Vibration konsequent dabei, die bevorzugte Orientierung aufzubrechen, was bewies, dass mechanisches Schütteln ein praktikabler Weg ist, um die Qualität dieser mikroskopischen Bilder zu verbessern. Die Forscher schlagen vor, dass dieser Ansatz mit anderen Techniken kombiniert werden könnte, um die Klarheit biologischer Strukturen weiter zu erhöhen und Wissenschaftlern, die die volle Form der Moleküle, die das Leben antreiben, sehen müssen, ein neues Werkzeug zu bieten.
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