An integration-free CRISPR platform for genetic dissection of respiratory virus host dependencies in human nasal epithelium
Questo studio stabilisce un flusso di lavoro CRISPR/Cas9 privo di integrazione per l'ingegneria genetica di cellule basali nasali umane al fine di creare colture a interfaccia aria-liquido editate geneticamente, le quali sono state utilizzate per validare ACE2 e TMPRSS2 come fattori ospiti critici per l'infezione da SARS-CoV-2 e hCoV-NL63 in un modello fisiologicamente rilevante.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
I virus che causano malattie respiratorie, dal comune raffreddore alle gravi pandemie, iniziano il loro viaggio atterrando sul rivestimento del naso. Questo sottile strato di tessuto, noto come epitelio nasale, funge da prima linea di difesa del corpo, una barriera complessa composta da molti tipi diversi di cellule che lavorano insieme. Per capire come questi virus riescano a penetrare questa barriera, gli scienziati devono studiare gli strumenti specifici che il virus utilizza per entrare nelle cellule. Per decenni, i ricercatori si sono affidati a semplici colture cellulari a strato singolo cresciute in piastre per testare quali proteine umane un virus potrebbe necessitare per infettare una persona. Tuttavia, queste cellule artificiali spesso si comportano diversamente rispetto al vero tessuto multistrato presente in un naso umano vivente. Sebbene gli scienziati abbiano recentemente sviluppato modelli migliori che imitano la struttura reale del rivestimento nasale, questi modelli realistici sono stati difficili da modificare geneticamente. Senza la capacità di attivare o disattivare facilmente specifici geni umani in questi modelli realistici, è stato difficile dimostrare esattamente quali parti del corpo umano un virus dirotti per dare inizio a un'infezione.
Un team di ricercatori della Duke-NUS Medical School di Singapore ha ora risolto questo problema creando un nuovo metodo per modificare i geni di queste cellule nasali realistiche. Hanno sviluppato un modo per utilizzare uno strumento molecolare preciso, noto come CRISPR, per tagliare via specifici geni nelle cellule staminali che crescono nel rivestimento nasale. A differenza dei metodi precedenti che richiedevano l'inserimento di materiale genetico estraneo nelle cellule, il che poteva causare cambiamenti imprevisti, questo nuovo approccio è "privo di integrazione", il che significa che non lascia alcuna traccia permanente dello strumento di editing. Gli scienziati hanno prima fatto crescere cellule nasali sane da un donatore, poi hanno utilizzato una miscela temporanea dello strumento di editing e di un marcatore fluorescente per tagliare via specifici geni. Successivamente, hanno selezionato le cellule che avevano ricevuto con successo lo strumento di editing, le hanno espanse e hanno permesso loro di maturare in uno strato di tessuto nasale completo e realistico. Questo processo ha permesso loro di creare un modello di tessuto in cui specifici geni erano mancanti, consentendo loro di vedere esattamente cosa accadeva quando il virus cercava di infettare un naso privo di quegli strumenti specifici.
Utilizzando questa nuova piattaforma, i ricercatori hanno testato come due diversi coronavirus, quello che causa il COVID-19 e un altro virus del comune raffreddore, infettano il naso umano. Hanno prima rimosso il gene per una proteina chiamata ACE2, che funge da porta principale per l'ingresso di questi virus nella cellula. Quando hanno infettato il tessuto modificato, i virus non sono riusciti a entrare, confermando che ACE2 è assolutamente essenziale per entrambi i virus per infettare il naso umano. Successivamente, hanno investigato una seconda proteina, la TMPRSS2, che agisce come una chiave che scardina la porta una volta che il virus è arrivato in superficie. Studi precedenti avevano suggerito che i virus potessero usare chiavi diverse a seconda del tipo di cellula, ma questa nuova ricerca ha dimostrato che nel tessuto nasale realistico, il virus si affida quasi interamente alla TMPRSS2. Quando i ricercatori hanno rimosso il gene per la TMPRSS2, i virus non sono stati in grado di infettare il tessuto, provando che questa specifica proteina è la chiave critica di cui il virus ha bisogno per entrare nelle cellule nasali umane.
Lo studio ha anche escluso altre potenziali vie che il virus potrebbe utilizzare. I ricercatori hanno testato se i virus potessero entrare nella cellula attraverso una rotta diversa che coinvolge il macchinario cellulare interno, ma hanno scoperto che bloccare questa rotta non aveva alcun effetto sull'infezione. Ciò ha confermato che, nel naso umano, il virus non utilizza questi metodi di ingresso alternativi. I risultati sono stati coerenti tra diversi donatori, dimostrando che la dipendenza da queste due proteine è una caratteristica fondamentale di come questi virus infettano gli esseri umani. Dimostrando che questi virus dipendono da specifiche proteine umane per entrare nel naso, lo studio fornisce un bersaglio chiaro per futuri trattamenti medici. Se gli scienziati riusciranno a sviluppare farmaci che blocchino o la porta o la chiave, potrebbero potenzialmente fermare il virus prima ancora che entri nel corpo. Questo nuovo metodo di modifica del tessuto nasale realistico apre la porta al test di molti altri virus e alla comprensione di come essi ci infettino esattamente, offrendo uno strumento potente per prepararsi alle future minacce respiratorie.
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