An integration-free CRISPR platform for genetic dissection of respiratory virus host dependencies in human nasal epithelium
本研究建立了一种无需整合的 CRISPR/Cas9 工作流程，用于对人类鼻基底细胞进行基因工程改造，以创建基因编辑的气-液界面培养模型，并利用该模型在生理相关模型中验证了 ACE2 和 TMPRSS2 是 SARS-CoV-2 和 hCoV-NL63 感染的关键宿主因子。
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从普通感冒到严重的全球大流行，引起呼吸道疾病的病毒其旅程始于降落在鼻腔黏膜上。这层被称为鼻上皮的薄组织层是人体第一道防线，是一个由多种不同细胞协同工作的复杂屏障。为了理解这些病毒是如何突破这一屏障的，科学家需要研究病毒进入细胞所使用的特定工具。几十年来，研究人员一直依赖在培养皿中生长的简单单层细胞培养物，来测试病毒可能需要哪些人类蛋白质才能感染人体。然而，这些人工细胞的表现往往与活体人类鼻腔中发现的真实、多层组织有所不同。虽然科学家最近开发出了能模拟真实鼻腔衬里结构的更好模型，但这些逼真的模型一直难以进行基因改造。由于无法在这些逼真的模型中轻松地开启或关闭特定的的人类基因，科学家很难证明人体内的哪些部分被病毒劫持以启动感染。
新加坡杜克-新加坡国立大学医学院的一个研究小组现在通过创造一种编辑这些逼真鼻细胞基因的新方法，解决了这一问题。他们开发了一种使用被称为 CRISPR 的精确分子工具的方法，来切除生长成鼻腔衬里的干细胞中的特定基因。与以往需要向细胞中插入外源遗传物质（这可能会导致意外变化）的方法不同，这种新方法是“无整合”的，这意味着它不会在编辑工具背后留下永久痕迹。科学家首先从捐赠者那里培养出健康的鼻细胞，然后使用编辑工具和荧光标记物的临时混合物切除特定基因。随后，他们对成功接收了编辑工具的细胞进行筛选并使其扩增，最后让它们成熟为完整的、逼真的鼻组织层。这一过程使他们能够创建一个缺失了特定人类基因的组织模型，从而让他们能够观察当病毒尝试感染一个没有这些特定工具的鼻子时，究竟会发生什么。
利用这个新平台，研究人员测试了两种不同的冠状病毒——一种是导致 COVID-19 的病毒，另一种是常见的感冒病毒——是如何感染人类鼻腔的。他们首先移除了名为 ACE2 的蛋白质基因，该蛋白质充当这些病毒进入细胞的主要“门”。当他们感染编辑后的组织时，病毒无法进入，这证实了 ACE2 对于这两种病毒感染人类鼻腔是绝对必要的。接着，他们研究了第二种蛋白质 TMPRSS2，它就像一把“钥匙”，在病毒到达表面后解锁这扇门。此前的研究曾表明，病毒可能会根据细胞类型的不同而使用不同的钥匙，但这项新研究显示，在真实的鼻腔组织中，病毒几乎完全依赖于 TMPRSS2。当研究人员移除 TMPRSS2 的基因时，病毒无法感染该组织，这证明了这种特定的蛋白质是病毒进入人类鼻细胞所需的关键钥匙。
该研究还排除了病毒可能使用的其他途径。研究人员测试了病毒是否可以通过涉及细胞内部机制的不同路径进入细胞，但发现阻断这一路径对感染没有影响。这证实了在人类鼻腔中，病毒并不使用这些替代的进入方式。这些发现由于在不同捐赠者之间保持一致，表明对这两类蛋白质的依赖是这些病毒感染人类的一个基本特征。通过证明这些病毒依赖特定的蛋白质进入鼻子，该研究为未来的医疗手段提供了明确的目标。如果科学家能够开发出阻断这扇“门”或这把“钥匙”的药物，他们就有可能在病毒进入体内之前就将其拦截。这种编辑逼真鼻组织的新方法，为测试许多其他病毒以及理解它们如何感染我们打开了大门，为应对未来的呼吸道威胁提供了一个强大的工具。
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