An integration-free CRISPR platform for genetic dissection of respiratory virus host dependencies in human nasal epithelium
Deze studie vestigt een integratievrije CRISPR/Cas9-workflow voor het genetisch modificeren van menselijke nasale basale cellen om gene-edited lucht-vloeistof-interfaceculturen te creëren, die werden gebruikt om ACE2 en TMPRSS2 te valideren als kritieke gastfactoren voor SARS-CoV-2 en hCoV-NL63 infectie in een fysiologisch relevant model.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Virussen die luchtweginfecties veroorzaken, van de gewone verkoudheid tot ernstige pandemieën, beginnen hun reis door te landen op de bekleding van de neus. Deze dunne laag weefsel, bekend als het neusepitheel, fungeert als de eerste verdedigingslinie van het lichaam, een complexe barrière bestaande uit vele verschillende soorten cellen die samenwerken. Om te begrijpen hoe deze virussen door deze barrière breken, moeten wetenschappers de specifieke hulpmiddelen bestuderen die het virus gebruikt om de cellen binnen te dringen. Decennialang hebben onderzoekers vertrouwd op eenvoudige, enkelvoudige celculturen die in schaaltjes worden gekweekt om te testen welke menselijke eiwitten een virus nodig heeft om een persoon te infecteren. Deze kunstmatige cellen gedragen zich echter vaak anders dan het echte, meerlagige weefsel dat in een levende menselijke neus wordt gevonden. Hoewel wetenschappers onlangs betere modellen hebben ontwikkeld die de werkelijke structuur van de neusbekleding nabootsen, zijn deze realistische modellen moeilijk genetisch aan te passen gebleken. Zonder de mogelijkheid om specifieke menselijke genen in deze realistische modellen gemakkelijk aan of uit te zetten, is het moeilijk geweest om precies te bewijzen welk deel van het menselijk lichaam een virus kaapt om een infectie te starten.
Een team van onderzoekers aan de Duke-NUS Medical School in Singapore heeft dit probleem nu opgelost door een nieuwe methode te creëren om de genen van deze realistische neuscellen te bewerken. Ze hebben een manier ontwikkeld om een nauwkeurig moleculair instrument, bekend als CRISPR, te gebruiken om specifieke genen uit de stamcellen te knippen die uitgroeien tot de neusbekleding. In tegen tegenstelling tot eerdere methoden die vereisten dat er vreemd genetisch materiaal in de cellen werd ingebracht, wat onbedoelde veranderingen kon veroorzaken, is deze nieuwe aanpak "integratievrij", wat betekent dat het geen blijvend spoor van het bewerkingsinstrument achterlaat. De wetenschappers kweekten eerst gezonde neuscellen van een donor en gebruikten vervolgens een tijdelijk mengsel van het bewerkingsinstrument en een lichtgevende marker om specifieke genen weg te knippen. Vervolgens sorteerden ze de cellen die het bewerkingsinstrument succesvol hadden ontvangen, breidden ze uit en lieten ze rijpen tot een volledige, realistische neusweefsellayer. Dit proces stelde hen in staat om een weefselmodel te creëren waarbij specifieke menselijke genen ontbraken, waardoor ze precies konden zien wat er gebeurde wanneer het virus probeerde een neus te infecteren zonder die specifieke hulpmiddelen.
Met behulp van dit nieuwe platform testten de onderzoekers hoe twee verschillende coronavirussen, het virus dat COVID-19 veroorzaakt en een ander algemeen verkoudheidsvirus, de menselijke neus infecteren. Ze verwijderden eerst het gen voor een eiwit genaamd ACE2, dat fungeert als de belangrijkste deur voor deze virussen om de cel binnen te gaan. Wanneer ze het bewerkte weefsel infecteerden, konden de virussen niet naar binnen, wat bevestigde dat ACE2 absoluut essentieel is voor beide virussen om de menselijke neus te infecteren. Vervolgens onderzochten ze een tweede eiwit, TMPRSS2, dat werkt als een sleutel die de deur ontgrendelt zodra het virus bij de deur is. Eerdere studies hadden gesuggereerd dat virussen mogelijk verschillende sleutels gebruiken afhankelijk van het type cel, maar dit nieuwe onderzoek toonde aan dat het virus in het realistische neusweefsel bijna volledig afhankelijk is van TMPRSS2. Toen de onderzoekers het gen voor TMPRSS2 verwijderden, waren de virussen niet in staat het weefsel te infecteren, wat bewees dat dit specifieke eiwit de cruciale sleutel is die het virus nodig heeft om de menselijke neuscellen binnen te dringen.
De studie sloot ook andere mogelijke routes uit die het virus zou kunnen gebruiken. De onderzoekers testten of de virussen de cel via een andere route konden betreden die betrokken is bij de interne cellulaire machinerie, maar stelden vast dat het blokkeren van deze route geen effect had op de infectie. Dit bevestigde dat het virus in de menselijke neus deze alternatieve toegangsmethoden niet gebruikt. De bevindingen waren consistent bij verschillende donoren, wat aantoont dat de afhankelijkheid van deze twee eiwitten een fundamenteel kenmerk is van hoe deze virussen mensen infecteren. Door aan te tonen dat deze virussen afhankelijk zijn van specifieke menselijke eiwitten om de neus binnen te dringen, biedt de studie een duidelijk doelwit voor toekomstige medische behandelingen. Als wetenschappers medicijnen kunnen ontwikkelen die ofwel de deur of de sleutel blokkeren, zouden ze het virus potentieel kunnen stoppen voordat het überhaupt het lichaam binnenkomt. Deze nieuwe methode om realistisch neusweefsel te bewerken, opent de deur om veel andere virussen te testen en precies te begrijpen hoe zij ons infecteren, wat een krachtig instrument biedt voor de voorbereiding op toekomstige respiratoire dreigingen.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.