An integration-free CRISPR platform for genetic dissection of respiratory virus host dependencies in human nasal epithelium
Diese Studie etabliert einen integrationsfreien CRISPR/Cas9-Workflow zur genetischen Veränderung menschlicher nasaler Basalzellen zur Erstellung geneditierter Air-Liquid-Interface-Kulturen, welche verwendet wurden, um ACE2 und TMPRSS2 als kritische Wirtsfaktoren für eine SARS-CoV-2- und hCoV-NL63-Infektion in einem physiologisch relevanten Modell zu validieren.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Viren, die Atemwegserkrankungen verursachen, von der gewöhnlichen Erkältung bis hin zu schweren Pandemien, beginnen ihre Reise, indem sie auf der Auskleidung der Nase landen. Diese dünne Gewebeschicht, bekannt als Nasenepithel, fungiert als die erste Verteidigungslinie des Körpers – eine komplexe Barriere, die aus vielen verschiedenen Zelltypen besteht, die zusammenarbeiten. Um zu verstehen, wie diese Viren diese Barriere durchbrechen, müssen Wissenschaftler die spezifischen Werkzeuge untersuchen, die der Virus nutzt, um in die Zellen einzudringen. Jahrzehntelang haben Forscher einfache, einschichtige Zellkulturen in Schalen verwendet, um zu testen, welche menschlichen Proteine ein Virus benötigt, um einen Menschen zu infizieren. Diese künstlichen Zellen verhalten sich jedoch oft anders als das echte, mehrschichtige Gewebe, das in einer lebenden menschlichen Nase vorkommt. Obwohl Wissenschaftler vor kurzem bessere Modelle entwickelt haben, die die tatsächliche Struktur der Nasenauskleidung nachahmen, war es schwierig, diese realistischen Modelle genetisch zu modifizieren. Ohne die Fähigkeit, spezifische menschliche Gene in diesen realistischen Modellen leicht an- oder auszuschalten, war es schwer zu beweisen, welche Teile des menschlichen Körpers ein Virus genau entführt, um eine Infektion zu starten.
Ein Forschungsteam der Duke-NUS Medical School in Singapur hat dieses Problem nun gelöst, indem es eine neue Methode zur Editierung der Gene dieser realistischen Nasenzellen entwickelt hat. Sie entwickelten einen Weg, ein präzises molekulares Werkzeug, bekannt als CRISPR, zu nutzen, um spezifische Gene in den Stammzellen herauszuschneiden, die zu der Nasenauskleidung heranwachsen. Im Gegensatz zu früheren Methoden, die das Einfügen von fremdem genetischem Material in die Zellen erforderten, was unbeabsichtigte Veränderungen hätte verursachen können, ist dieser neue Ansatz „integrationsfrei“, was bedeutet, dass er keine dauerhafte Spur des Editierungswerkzeugs hinterlässt. Die Wissenschaftler züchteten zuerst gesunde Nasenzellen von einem Spender heran und verwendeten dann eine vorübergehende Mischung aus dem Editierungswerkzeug und einem leuchtenden Marker, um spezifische Gene herauszuschneiden. Anschließend sortierten sie die Zellen aus, die das Editierungswerkzeug erfolgreich erhalten hatten, vermehrten sie und ließen sie zu einer vollständigen, realistischen Nasengewebsschicht ausreifen. Dieser Prozess ermöglichte es ihnen, ein Gewebemodell zu schaffen, in dem bestimmte menschliche Gene fehlen, sodass sie genau sehen konnten, was geschah, wenn der Virus versuchte, eine Nase ohne diese spezifischen Werkzeuge zu infizieren.
Unter Verwendung dieser neuen Plattform testeten die Forscher, wie zwei verschiedene Coronaviren – das, welches COVID-19 verursacht, und ein anderes gewöhnliches Erkältungsvirus – die menschliche Nase infizieren. Zuerst entfernten sie das Gen für ein Protein namens ACE2, das als Haupttür fungiert, durch die diese Viren in die Zelle gelangen. Als sie das editierte Gewebe infizierten, konnten die Viren nicht eindringen, was bestätigte, dass ACE2 absolut essenziell dafür ist, dass beide Viren die menschliche Nase infizieren. Als Nächstes untersuchten sie ein zweites Protein, TMPRSS2, das wie ein Schlüssel wirkt, der die Tür aufschließt, sobald der Virus an der Oberfläche ankommt. Frühere Studien hatten nahegelegt, dass Viren je nach Zelltyp unterschiedliche Schlüssel verwenden könnten, aber diese neue Forschung zeigte, dass der Virus im realistischen Nasengewebe fast ausschließlich auf TMPRSS2 angewiesen ist. Als die Forscher das Gen für TMPRSS2 entfernten, waren die Viren nicht in der Lage, das Gewebe zu infizieren, was bewies, dass dieses spezifische Protein der entscheidende Schlüssel ist, den der Virus benötigt, um in menschliche Nasenzellen einzudringen.
Die Studie schloss auch andere potenzielle Wege aus, die der Virus nutzen könnte. Die Forscher testeten, ob die Viren über einen anderen Weg unter Beteiligung der internen zellulären Maschinerie in die Zelle gelangen könnten, stellten jedoch fest, dass das Blockieren dieses Weges keinen Effekt auf die Infektion hatte. Dies bestätigte, dass der Virus in der menschlichen Nase diese alternativen Eintrittsmethoden nicht nutzt. Die Ergebnisse waren bei verschiedenen Spendern konsistent und zeigten, dass die Abhängigkeit von diesen zwei Proteinen ein grundlegendes Merkmal dafür ist, wie diese Viren Menschen infizieren. Indem sie demonstrierten, dass diese Viren auf spezifische menschliche Proteine angewiesen sind, um in die Nase einzudringen, liefert die Studie ein klares Ziel für zukünftige medizinische Behandlungen. Wenn es Wissenschaftlern gelingt, Medikamente zu entwickeln, die entweder die Tür oder den Schlüssel blockieren, könnten sie das Virus potenziell stoppen, bevor es überhaupt in den Körper gelangt. Diese neue Methode zur Editierung von realistischem Nasengewebe öffnet die Tür für das Testen vieler anderer Viren und das Verständnis darüber, wie sie uns genau infizieren, was ein leistungsstarkes Werkzeug zur Vorbereitung auf zukünftige respiratorische Bedrohungen bietet.
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