An integration-free CRISPR platform for genetic dissection of respiratory virus host dependencies in human nasal epithelium
Este estudo estabelece um fluxo de trabalho CRISPR/Cas9 livre de integração para a engenharia genética de células basais nasais humanas para criar culturas de interface ar-líquido editadas geneticamente, as quais foram utilizadas para validar o ACE2 e o TMPRSS2 como fatores hospedeiros críticos para a infecção por SARS-CoV-2 e hCoV-NL63 em um modelo fisiologicamente relevante.
Artigo original sob licença CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Esta é uma explicação gerada por IA de um preprint que não foi revisado por pares. Não é aconselhamento médico. Não tome decisões de saúde com base neste conteúdo. Ler aviso legal completo
Vírus que causam doenças respiratórias, desde o resfriado comum até pandemias graves, iniciam sua jornada ao pousar no revestimento do nariz. Esta fina camada de tecido, conhecida como epitélio nasal, atua como a primeira linha de defesa do corpo, uma barreira complexa composta por muitos tipos diferentes de células trabalhando em conjunto. Para entender como esses vírus rompem essa barreira, os cientistas precisam estudar as ferramentas específicas que o vírus usa para entrar nas células. Durante décadas, pesquisadores confiaram em culturas de células simples, de camada única, cultivadas em placas para testar quais proteínas humanas um vírus poderia precisar para infectar uma pessoa. No entanto, essas células artificiais costumam se comportar de forma diferente do tecido real, multicamadas, encontrado em um nariz humano vivo. Embora cientistas tenham desenvolvido recentemente modelos melhores que mimetizam a estrutura real do revestimento nasal, esses modelos realistas têm sido difíceis de modificar geneticamente. Sem a capacidade de ligar ou desligar facilmente genes humanos específicos nesses modelos realistas, tem sido difícil provar exatamente quais partes do corpo humano um vírus sequestra para iniciar uma infecção.
Uma equipe de pesquisadores da Escola Médica Duke-NUS, em Singapura, resolveu agora este problema ao criar um novo método para editar os genes dessas células nasais realistas. Eles desenvolveram uma maneira de usar uma ferramenta molecular precisa, conhecida como CRISPR, para remover genes específicos nas células-tronco que crescem até se tornarem o revestimento nasal. Ao contrário de métodos anteriores que exigiam a inserção de material genético estranho nas células, o que poderia causar mudanças indesejadas, esta nova abordagem é "livre de integração", o que significa que não deixa nenhum traço permanente da ferramenta de edição. Os cientistas primeiro cultivaram células nasais saudáveis de um doador, depois usaram uma mistura temporária da ferramenta de edição e um marcador brilhante para remover genes específicos. Em seguida, eles selecionaram as células que receberam com sucesso a ferramenta de edição, as expandiram e permitiram que amadurecessem até se tornarem uma camada de tecido nasal completa e realista. Esse processo permitiu que criassem um modelo de tecido onde genes humanos específicos estavam ausentes, permitindo que vissem exatamente o que acontecia quando o vírus tentava infectar um nariz sem essas ferramentas específicas.
Usando esta nova plataforma, os pesquisadores testaram como dois coronavírus diferentes, o que causa a COVID-19 e outro vírus do resfriado comum, infectam o nariz humano. Primeiro, eles removeram o gene para uma proteína chamada ACE2, que atua como a porta principal para esses vírus entrarem na célula. Quando infectaram o tecido editado, os vírus não conseguiram entrar, confirmando que a ACE2 é absolutamente essencial para ambos os vírus infectarem o nariz humano. Em seguida, investigaram uma segunda proteína, a TMPRSS2, que atua como uma chave que destranca a porta uma vez que o vírus chega à superfície. Estudos anteriores sugeriram que os vírus poderiam usar chaves diferentes dependendo do tipo de célula, mas esta nova pesquisa mostrou que, no tecido nasal realista, o vírus depende quase inteiramente da TMPRSS2. Quando os pesquisadores removeram o gene para a TMPRSS2, os vírus foram incapazes de infectar o tecido, provando que esta proteína específica é a chave crítica que o vírus precisa para entrar nas células nasais humanas.
O estudo também descartou outras vias potenciais que o vírus poderia usar. Os pesquisadores testaram se os vírus poderiam entrar na célula através de uma rota diferente envolvendo o maquinário celular interno, mas descobriram que bloquear essa rota não teve efeito na infecção. Isso confirmou que, no nariz humano, o vírus não utiliza esses métodos de entrada alternativos. Os achados foram consistentes entre diferentes doadores, mostrando que a dependência dessas duas proteínas é uma característica fundamental de como esses vírus infectam os humanos. Ao demonstrar que esses vírus dependem de proteínas humanas específicas para entrar no nariz, o estudo fornece um alvo claro para futuros tratamentos médicos. Se os cientistas conseguirem desenvolver medicamentos que bloqueiem tanto a porta quanto a chave, eles poderiam potencialmente deter o vírus antes mesmo de ele entrar no corpo. Este novo método de editar o tecido nasal realista abre as portas para testar muitos outros vírus e entender exatamente como eles nos infectam, oferecendo uma ferramenta poderosa para nos prepararmos para futuras ameaças respiratórias.
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