CountAnywhere: frugal cell counting and viability from smartphone hemocytometer photos

In quasi ogni laboratorio dove gli scienziati coltivano cellule viventi, ogni giorno si svolge un compito di routine ma critico: contarle. Prima che i ricercatori possano studiare come un farmaco influenzi un tumore, come un virus infetti un tessuto o come le cellule staminali si trasformino in nuovi organi, devono sapere esattamente quante cellule hanno e quante sono ancora vive. Per decenni, questo è stato fatto con un vetrino chiamato emocitometro, che contiene una minuscola goccia di liquido sopra una griglia incisa sulla sua superficie. Uno scienziato posiziona questo vetrino sotto un microscopio, guarda attraverso l'oculare e conta manualmente le cellule nei quadrati della griglia. È un processo lento e tedioso che si affida interamente all'occhio umano e alla pazienza di chi effettua il conteggio. Poiché le persone si stancano o si distraggono, due scienziati diversi potrebbero contare la stessa goccia di cellule e ottenere numeri differenti. Per risolvere questo problema, molti laboratori ora acquistano costose macchine automatizzate che contano le cellule per loro, ma questi dispositivi costano migliaia di dollari e richiedono vetrini monouso speciali per ogni singolo campione, il che si traduce in costi significativi nel tempo.

Un team di ricercatori della University of Maryland School of Medicine ha sviluppato un nuovo modo per gestire questo problema che non richiede macchine costose né vetrini speciali. Hanno creato uno strumento gratuito, basato su browser, chiamato CountAnywhere, che trasforma uno smartphone standard in un contatore di cellule. Il sistema funziona scattando una fotografia del vetrino attraverso un microscopio e utilizzando la griglia già incisa sul vetrino per fare i calcoli. Invece di affidarsi a uno strumento dedicato, il software utilizza le linee della griglia come un righello per misurare l'area, controlla se l'immagine è abbastanza nitida da essere utile e poi identifica e conta automaticamente ogni cellula nell'immagine. Determina anche se ogni cellula è viva o morta controllando quanto appare scura o chiara rispetto al suo immediato intorno. Questo approccio elimina la necessità di attrezzature costose e materiali monouso, rendendo il conteggio cellulare accurato accessibile a qualsiasi laboratorio dotato di un microscopio e di un telefono.

I ricercatori hanno costruito questo sistema affinché funzionasse con le fotografie ordinarie che gli scienziati scattano già quando osservano le cellule. Quando un utente carica quattro foto dei quadrati della griglia da un vetrino standard, il software trova prima le linee della griglia nell'immagine. Utilizza queste linee per correggere qualsiasi inclinazione o distorsione della foto, assicurando che l'area misurata sia esattamente un millimetro quadrato, indipendentemente dalla distanza tra il telefono e il microscopio o dal tipo di telefono utilizzato. Questo passaggio è fondamentale perché trasforma un semplice scatto in uno strumento di misurazione preciso. Una volta corretta l'immagine, il software scansiona l'area per trovare le cellule. Nei primi test, un programma informatico generico progettato per trovare oggetti nelle immagini perdeva molte cellule, specialmente quando erano ammassate o molto simili allo sfondo. Per risolvere il problema, i ricercatori hanno addestrato il software specificamente su immagini di cinque diversi tipi di cellule, mostrandogli migliaia di esempi di come queste cellule appaiono in un emocitometro. Questo addestramento ha permesso al software di riconoscere le cellule con alta precisiono, trovandone quasi tutte anche in condizioni di affollamento.

Dopo che il software ha identificato le cellule, decide quali sono vive e quali sono morte. In questo metodo, gli scienziati spesso mescolano le cellule con un colorante blu che entra solo nelle cellule con membrane danneggiate, ovvero quelle morte. Le cellule viventi rimangono luminose e chiare, mentre quelle morte diventano blu scuro. Il software misura la luminosità di ogni cella e la confronta con la luminosità del liquido immediatamente adiacente. Se la cellula è più scura del suo intorno, il programma la marca come morta; se è più luminosa, la marca come viva. Questa regola è semplice e non richiede calcoli complessi o aggiustamenti per diversi tipi di cellule. I ricercatori hanno testato questo metodo su migliaia di cellule provenienti da cinque diverse linee cellulari e hanno scoperto che identificava correttamente le cellule vive e morte con un livello di accuratezza che corrispondeva a quello degli esperti umani.

Per vedere quanto bene questo nuovo metodo funzionasse nel mondo reale, i ricercatori lo hanno confrontato sia con il conteggio manuale effettuato dagli esseri umani, sia con il conteggio tramite una macchina automatizzata commerciale. Hanno analizzato 128 diverse sezioni di campioni cellulari. I risultati hanno mostato che l'app per smartphone concordava con il conteggio reale più strettamente rispetto ai contatori umani. Quando le persone contavano le cellule a mano, tendevano a perdere più cellule all'aumentare del numero di cellule nel campione, portando a conteggi inferiori rispetto a quelli realmente presenti. L'app, tuttavia, non commetteva questo errore; contava la stessa proporzione di cellule sia che il campione fosse rado o molto affollato. In termini di velocità, l'app era anche significativamente più veloce. Un conteggio completo di un campione richiedeva circa 50 secondi usando l'app, mentre il conteggio manuale richiedeva in media 122 secondi. La macchina commerciale era la più veloce, con circa 17 secondi, ma richiedeva uno strumento dedicato e un vetrino monouso per ogni campione, mentre l'app utilizzava solo il vetrino di vetro riutilizzabile e un telefono.

I ricercatori hanno validato le loro scoperte attraverso molteplici sessioni utilizzando diversi tipi di cellule e diversi modelli di smartphone, inclusi dispositivi Android e Apple. Hanno confermato che il sistema funziona in modo affidabile finché l'immagine è a fuoco e la griglia è visibile. Hanno inoltre notato che il software può essere eseguito su un computer locale all'interno di un laboratorio, il che significa che non richiede nemmeno una connessione internet per funzionare, un aspetto importante per i laboratori in aree remote o con rigide regole di sicurezza dei dati. Lo studio conclude che questo metodo democratizza il conteggio cellulare eliminando le barriere finanziarie e tecniche che hanno mantenuto il conteggio automatizzato accurato fuori dalla portata di molti laboratori più piccoli. Utilizzando la griglia già presente sul vetrino, il sistema trasforma un normale pezzo di attrezzatura da laboratorio in uno strumento potente, preciso ed economico per misurare la vita a livello cellulare.