CountAnywhere: frugal cell counting and viability from smartphone hemocytometer photos

Em quase todos os laboratórios onde cientistas cultivam células vivas, uma tarefa rotineira, mas crítica, acontece diariamente: contá-las. Antes que pesquisadores possam estudar como um medicamento afeta um tumor, como um vírus infecta um tecido ou como células-tronco se transformam em novos órgãos, eles precisam saber exatamente quantas células possuem e quantas ainda estão vivas. Por décadas, isso tem sido feito com uma lâmina de vidro chamada hemocitômetro, que contém uma minúscula gota de líquido sobre uma grade gravada em sua superfície. Um cientista coloca essa lâmina sob um microscópio, olha através da ocular e faz a contagem manual das células nos quadrados da grade. É um processo lento e tedioso que depende inteiramente do olho humano e da paciência da pessoa que realiza a contagem. Como as pessoas ficam cansadas ou distraídas, dois cientistas diferentes podem contar a mesma gota de células e obter números diferentes. Para resolver isso, muitos laboratórios agora compram máquinas automatizadas caras que contam as células para eles, mas esses dispositivos custam milhares de dólares e exigem lâminas descartáveis especiais para cada amostra, o que gera custos significativos ao longo do tempo.

Uma equipe de pesquisadores da Escola de Medicina da Universidade de Maryland desenvolveu uma nova maneira de lidar com esse problema que não requer máquinas caras nem lâminas especiais. Eles criaram uma ferramenta gratuita, baseada em navegador, chamada CountAnywhere, que transforma um smartphone padrão em um contador de células. O sistema funciona tirando uma fotografia da lâmina de vidro através de um microscópio e usando a grade já gravada na lâmina para fazer o cálculo. Em vez de depender de um instrumento dedicado, o software usa as linhas da grade como uma régua para medir a área, verifica se a imagem está nítida o suficiente para ser útil e, em seguida, identifica e conta automaticamente cada célula na imagem. Ele também determina se cada célula está viva ou morta, verificando o quão escura ou clara ela aparece em relação ao seu entorno imediato. Essa abordagem elimina a necessidade de equipamentos caros e materiais descartáveis, tornando a contagem de células precisa acessível a qualquer laboratório que possua um microscópio e um telefone.

Os pesquisadores construíram este sistema para funcionar com as fotografias comuns que os cientistas já tiram quando observam as células. Quando um usuário carrega quatro fotos dos quadrados da grade de uma lâmina de vidro padrão, o software primeiro encontra as linhas da grade na imagem. Ele utiliza essas linhas para corrigir qualquer inclinação ou distorção na foto, garantindo que a área sendo medida seja exatamente um milímetro quadrado, independentemente de quão longe o telefone estava do microscópio ou de qual tipo de telefone foi usado. Esta etapa é crucial porque transforma um simples instantâneo em uma ferramenta de medição precisa. Uma vez que a imagem é corrigida, o software varre a área para encontrar as células. Em testes iniciais, um programa de computador de uso geral projetado para encontrar objetos em imagens deixou passar muitas células, especialmente quando elas estavam aglomeradas ou pareciam muito semelhantes ao fundo. Para corrigir isso, os pesquisadores treinaram o software especificamente com imagens de cinco tipos diferentes de células, mostrando a ele milhares de exemplos de como essas células se parecem em um hemocitômetro. Esse treinamento permitiu que o software reconhecesse as células com alta precisão, encontrando quase todas elas mesmo em condições de aglomeração.

Depois que o software identifica as células, ele decide quais estão vivas e quais estão mortas. Neste método, os cientistas frequentemente misturam as células com um corante azul que só entra em células com membranas danificadas, que são as mortas. As células vivas permanecem brilhantes e claras, enquanto as mortas tornam-se azul-escuras. O software mede o brilho de cada célula e o compara com o brilho do líquido imediatamente ao lado dela. Se a célula for mais escura que o seu entorno, o programa a marca como morta; se for mais clara, a marca como viva. Esta regra é simples e não requer cálculos complexos ou ajustes para diferentes tipos de células. Os pesquisadores testaram este método em milhares de células de cinco linhagens celulares diferentes e descobriram que ele identificou corretamente células vivas e mortas com um nível de precisão que igualou o de especialistas humanos.

Para ver quão bem este novo método funcionou no mundo real, os pesquisadores o compararam tanto com a contagem manual feita por humanos quanto com a contagem por uma máquina automatizada comercial. Eles analisaram 128 seções diferentes de amostras de células. Os resultados mostraram que o aplicativo de smartphone concordou com a contagem real mais de perto do que os contadores humanos. Quando as pessoas contavam as células à mão, tendiam a perder mais células conforme o número de células na amostra aumentava, levando a contagens menores do que as realmente presentes. O aplicativo, no entanto, não cometeu esse erro; ele contou a mesma proporção de células, fosse a amostra escassa ou muito densa. Em termos de velocidade, o aplicativo também foi significativamente mais rápido. Uma contagem completa de uma amostra levou cerca de 50 segundos usando o aplicativo, enquanto a contagem manual levou, em média, 122 segundos. A máquina comercial foi a mais rápida, com cerca de 17 segundos, mas exigia um instrumento dedicado e uma lâmina descartável para cada amostra, enquanto o aplicativo utilizava apenas a lâmina de vidro reutilizável e um telefone.

Os pesquisadores validaram suas descobertas através de múltiplas sessões utilizando diferentes tipos de células e diferentes modelos de smartphone, incluindo dispositivos Android e Apple. Eles confirmaram que o sistema funciona de forma confiável, desde que a imagem esteja em foco e a grade esteja visível. Eles também observaram que o software pode ser executado em um computador local dentro de um laboratório, o que significa que nem sequer precisa de uma conexão com a internet para funcionar, algo importante para laboratórios em áreas remotas ou aqueles com regras estritas de segurança de dados. O estudo conclui que este método democratiza a contagem de células ao remover as barreiras financeiras e técnicas que mantiveram a contagem automatizada e precisa fora do alcance de muitos laboratórios menores. Ao utilizar a grade que já está presente na lâmina de vidro, o sistema transforma um equipamento laboratorial padrão em uma ferramenta poderosa, precisa e acessível para medir a vida no nível celular.