CountAnywhere: frugal cell counting and viability from smartphone hemocytometer photos

In bijna elk laboratorium waar wetenschappers levende cellen kweken, vindt dagelijks een routineuze maar cruciale taak plaats: het tellen ervan. Voordat onderzoekers kunnen bestuderen hoe een medicijn een tumor beïnvloedt, hoe een virus weefsel infecteert of hoe stamcellen veranderen in nieuwe organen, moeten ze precies weten hoeveel cellen ze hebben en hoeveel daarvan nog leven. Decennialang is dit gedaan met een glazen objectglas genaamd een hemocytometer, die een klein druppeltje vloeistof vasthoudt boven een rooster dat in het oppervlak is gegraveerd. Een wetenschapper plaatst dit objectglas onder een microscoop, kijkt door het oculair en telt handmatig de cellen in de rooster vierkantjes. Het is een traag, eentonig proces dat volledig vertrouwt op het menselijk oog en het geduld van de persoon die de telling uitvoert. Omdat mensen moe worden of afgeleid raken, kunnen twee verschillende wetenschappers dezelfde druppel cellen tellen en verschillende aantallen krijgen. Om dit op te lossen, kopen veel laboratoria nu dure automatische machines die de cellen voor hen tellen, maar deze apparaten kosten duizenden dollars en vereisen speciale wegwerpglaasjes voor elk afzonderlijk monster, wat over tijd oploopt tot aanzienlijke kosten.

Een team van onderzoekers aan de University of Maryland School of Medicine heeft een nieuwe manier ontwikkeld om dit probleem aan te pakken, die geen dure machine en geen speciale glaasjes vereist. Ze hebben een gratis, browsergebaseerde tool ontwikkeld genaamd CountAnywhere, die een standaard smartphone verandert in een celsteller. Het systeem werkt door een foto te maken van het glazen objectglas door een microscoop en gebruikt het rooster dat al in het objectglas gegraveerd staat om de berekening uit te voeren. In plaats van te vertrouwen op een specifiek instrument, gebruikt de software de roosterlijnen als liniaal om het oppervlak te meten, controleert of de afbeelding scherp genoeg is om nuttig te zijn, en identificeert en telt vervolgens automatisch elke cel in de foto. Het bepaalt ook of elke cel leeft of dood is door te controleren hoe donker of licht deze verschijnt in vergelijking met de directe omgeving. Deze aanpak elimineert de noodzaak voor kostbare apparatuur en verbruiksmaterialen, waardoor nauwkeurig cel tellen toegankelijk wordt voor elk laboratorium met een microscoop en een telefoon.

De onderzoekers hebben dit systeem gebouwd om te werken met de gewone foto's die wetenschappers al maken wanneer ze naar cellen kijken. Wanneer een gebruiker vier foto's van de rooster vierkantjes van een standaard glazen objectglas uploadt, zoekt de software eerst de roosterlijnen in de afbeelding. Het gebruikt deze lijnen om eventuele kanteling of vervorming in de foto te corrigeren, waardoor wordt gegarandeerd dat het gemeten gebied exact één vierkante millimeter is, ongeacht hoe ver de telefoon van de microscoop af was of wat voor soort telefoon werd gebruikt. Deze stap is cruciaal omdat het een eenvoudige snapshot verandert in een nauwkeurig meetinstrument. Zodra de afbeelding is gecorrigeerd, scant de software het gebied om de cellen te vinden. In vroege tests mist een algemeen computerprogramma dat ontworpen is om objecten in afbeeldingen te vinden, veel van de cellen, vooral wanneer ze dicht op elkaar gepakt zitten of erg lijken op de achtergrond. Om dit op te lossen, hebben de onderzoekers de software specifiek getraind op afbeeldingen van vijf verschillende soorten cellen, waarbij ze de software duizenden voorbeelden lieten zien van hoe deze cellen eruitzien in een hemocytometer. Deze training stelde de software in staat om de cellen met een hoge nauwkeurigheid te herkennen, waarbij bijna elke cel werd gevonden, zelfs in drukke omstandigheden.

Nadat de software de cellen heeft geïdentificeerd, beslist het welke cellen leven en welke dood zijn. In deze methode mengen wetenschappers de cellen vaak met een blauwe kleurstof die alleen binnendringt in cellen met beschadigde membranen, wat de dode cellen zijn. De levende cellen blijven helder en duidelijk, terwijl de dode cellen donkerblauw worden. De software meet de helderheid van elke cel en vergelijkt deze met de helderheid van de vloeistof direct naast de cel. Als de cel donkerder is dan zijn omgeving, markeert het programma de cel als dood; als de cel helderder is, markeert het de cel als levend. Deze regel is eenvoudig en vereist geen complexe berekeningen of aanpassingen voor verschillende soorten cellen. De onderzoekers testten deze methode op duizenden cellen van vijf verschillende cellijnen en stelden vast dat het systeem levende en dode cellen correct identificeerde met een nauwkeurigheidsniveau dat overeenkwam met dat van menselijke experts.

Om te zien hoe goed deze nieuwe methode in de echte wereld werkte, vergeleken de onderzoekers het met zowel handmatige telling door mensen als telling door een commerciële automatische machine. Ze analyseerden 128 verschillende secties van celmonsters. De resultaten lieten zien dat de smartphone-app dichter bij de werkelijke telling kwam dan de menselijke tellers. Wanneer mensen de cellen met de hand telden, hadden zij de neiging om meer cellen te missen naarmate het aantal cellen in het monster toenam, wat leidde tot lagere aantallen dan er daadwerkelijk aanwezig waren. De app maakte deze fout echter niet; het telde hetzelfde aandeel cellen, of het monster nu ijl of zeer druk was. Wat snelheid betreiment, was de app ook aanzienlijk sneller. Een volledige telling van een monster duurde ongeveer 50 second second met de app, terwijl handmatige telling gemiddeld 122 seconden duurde. De commerciële machine was het snelst met ongeveer 17 seconden, maar vereiste een specifiek instrument en een wegwerpglaasje voor elk monster, terwijl de app alleen het herbruikbare glazen objectglas en een telefoon gebruikte.

De onderzoekers valideerden hun bevindingen over meerdere sessies met verschillende soorten cellen en verschillende smartphone-modellen, inclusie zowel Android- als Apple-apparaten. Ze bevestigden dat het systeem betrouwbaar werkt zolang de afbeelding in focus is en het rooster zichtbaar is. Ze merkten ook op dat de software op een lokale computer binnen een laboratorium kan worden uitgevoerd, wat betekent dat er zelfs geen internetverbinding nodig is om te functioneren, wat belangrijk is voor laboratoria in afgelegen gebieden of die strikte regels hebben voor gegevensbeveiliging. De studie concludeert dat deze methode het tellen van cellen democratiseert door de financiële en technische barrières weg te nemen die nauwkeurig, automatisch tellen buiten het bereik hebben gehouden van veel kleinere laboratoria. Door gebruik te maken van het rooster dat al op het glazen objectglas aanwezig is, transformeert het systeem een standaard stuk laboratoriumapparatuur in een krachtig, nauwkeurig en betaalbaar instrument voor het meten van leven op cellulair niveau.