CountAnywhere: frugal cell counting and viability from smartphone hemocytometer photos

In fast jedem Labor, in dem Wissenschaftler lebende Zellen züchten, findet täglich eine routinemäßige, aber kritische Aufgabe statt: das Zählen derselben. Bevor Forscher untersuchen können, wie ein Medikament einen Tumor beeinflusst, wie ein Virus Gewebe infiziert oder wie Stammzellen zu neuen Organen werden, müssen sie genau wissen, wie viele Zellen sie haben und wie viele davon noch am Leben sind. Jahrzehntelang wurde dies mit einem Glasobjektträger namens Hämozytometer durchgeführt, der einen winzigen Tropfen Flüssigkeit über einem in seine Oberfläche geätzten Gitter hält. Ein Wissenschaftler platziert diesen Objektträger unter einem Mikroskop, blickt durch das Okular und zählt die Zellen in den Gitternetzquadraten manuell ab. Es ist ein langsamer, mühsamer Prozess, der sich vollständig auf das menschliche Auge und die Geduld der Person verlassen muss, die die Zählung durchführt. Da Menschen müde werden oder abgelenkt werden können, könnten zwei verschiedene Wissenschaftler denselben Tropfen Zellen zählen und unterschiedliche Ergebnisse erhalten. Um dies zu lösen, kaufen viele Labore heute teure automatisierte Maschinen, die die Zellen für sie zählen, aber diese Geräte kosten Tausende von Dollar und erfordern für jede einzelne Probe spezielle Einwegobjektträger, was im Laufe der Zeit zu erheblichen Kosten führt.

Ein Team von Forschern der University of Maryland School of Medicine hat einen neuen Weg entwickelt, um dieses Problem zu handhaben, der weder eine teure Maschine noch spezielle Objektträger erfordert. Sie haben ein kostenloses, browserbasiertes Tool namens CountAnywhere entwickelt, das ein Standard-Smartphone in einen Zellzähler verwandelt. Das System funktioniert, indem es ein Foto des Glasobjektträgers durch ein Mikroskop macht und das bereits auf dem Objektträger eingravierte Gitter verwendet, um die Berechnungen durchzuführen. Anstatt sich auf ein spezielles Instrument zu verlassen, nutzt die Software die Gitternetzlinien als Lineal, um die Fläche zu messen, prüft, ob das Bild scharf genug ist, um nützlich zu sein, und identifiziert und zählt dann automatisch jede Zelle im Bild. Sie bestimmt auch, ob eine Zelle lebendig oder tot ist, indem sie prüft, wie dunkel oder hell sie im Vergleich zu ihrer unmittelbaren Umgebung erscheint. Dieser Ansatz macht den Bedarf an kostspieliger Ausrüstung und Einwegmaterialien hinfällig und macht eine genaue Zellzählung für jedes Labor mit einem Mikroskop und einem Telefon zugänglich.

Die Forscher haben dieses System so gebaut, dass es mit den gewöhnlichen Fotografien funktioniert, die Wissenschaftler bereits aufnehmen, wenn sie Zellen betrachten. Wenn ein Benutzer vier Bilder der Gitternetzquadrate eines Standard-Glasobjektträgers hochlädt, findet die Software zuerst die Gitternetzlinien im Bild. Sie nutzt diese Linien, um etwaige Neigungen oder Verzerrungen im Foto zu korrigieren, wodurch sichergestellt wird, dass die gemessene Fläche exakt ein Quadratmillimeter beträgt, unabhängig davon, wie weit das Telefon vom Mikroskop entfernt war oder welche Art von Telefon verwendet wurde. Dieser Schritt ist entscheidend, da er ein einfaches Schnappschussfoto in ein präzises Messwerkzeug verwandelt. Sobald das Bild korrigiert wurde, scannt die Software den Bereich, um die Zellen zu finden. In frühen Tests übersah ein allgemeines Computerprogramm, das darauf ausgelegt ist, Objekte in Bildern zu finden, viele der Zellen, insbesondere wenn diese dicht gedrängt lagen oder dem Hintergrund sehr ähnlich sahen. Um dies zu beheben, trainierten die Forscher die Software spezifisch auf Bilder von fünf verschiedenen Zelltypen und zeigten ihr tausende Beispiele dafür, wie diese Zellen in einem Hämozytom aussehen. Dieses Training ermöglichte es der Software, die Zellen mit hoher Genauigkeit zu erkennen und nahezu jede einzelne Zelle selbst unter dichten Bedingungen zu finden.

Nachdem die Software die Zellen identifiziert hat, entscheidet sie, welche davon lebendig und welche tot sind. Bei dieser Methode mischen Wissenschaftler die Zellen oft mit einem blauen Farbstoff, der nur in Zellen mit beschädigten Membranen eindringt, also in die toten Zellen. Die lebenden Zellen bleiben hell und klar, während die toten Zellen dunkelblau werden. Die Software misst die Helligkeit jeder Zelle und vergleicht sie mit der Helligkeit der Flüssigkeit direkt daneben. Wenn die Zelle dunkler als ihre Umgebung ist, markiert das Programm sie als tot; wenn sie heller ist, markiert es sie als lebendig. Diese Regel ist einfach und erfordert keine komplexen Berechnungen oder Anpassungen für verschiedene Zelltypen. Die Forscher testeten diese Methode an tausenden Zellen aus fünf verschiedenen Zelllinien und fanden heraus, dass sie lebende und tote Zellen mit einer Genauigkeit identifizierte, die der von menschlichen Experten entsprach.

Um zu sehen, wie gut diese neue Methode in der realen Welt funktionierte, verglichen die Forscher sie sowohl mit der manuellen Zählung durch Menschen als auch mit der Zählung durch eine kommerzielle automatisierte Maschine. Sie analysierten 128 verschiedene Abschnitte von Zellproben. Die Ergebnisse zeigten, dass die Smartphone-App der wahren Zählzahl genauer entsprach als die menschlichen Zähler. Wenn Menschen die Zellen von Hand zählten, neigten sie dazu, mehr Zellen zu übersehen, sobald die Anzahl der Zellen in der Probe anstieg, was zu niedrigeren Zählungen führte, als tatsächlich vorhanden waren. Die App jedoch machte diesen Fehler nicht; sie zählte denselben Anteil an Zellen, egal ob die Probe spärlich oder sehr dicht besiedelt war. In Bezug auf die Geschwindigkeit war die App ebenfalls signifikant schneller. Eine vollständige Zählung einer Probe dauerte mit der App etwa 50 Sekunden, während die manuelle Zählung im Durchschnitt 122 Sekunden dauerte. Die kommerzielle Maschine war mit etwa 17 Sekunden am schnellsten, erforderte jedoch ein dediziertes Instrument und einen Einwegobjektträger für jede Probe, während die App nur den wiederverwendbaren Glasobjektträger und ein Telefon nutzte.

Die Forscher validierten ihre Ergebnisse über mehrere Sitzungen hinweg unter Verwendung verschiedener Zelltypen und verschiedener Smartphone-Modelle, einschließlich sowohl Android- als auch Apple-Geräten. Sie bestätigten, dass das System zuverlässig funktioniert, solange das Bild im Fokus ist und das Gitter sichtbar ist. Sie stellten auch fest, dass die Software auf einem lokalen Computer innerhalb eines Labors ausgeführt werden kann, was bedeutet, dass sie nicht einmal eine Internetverbindung benötigt, um zu funktionieren, was für Labore in abgelegenen Gebieten oder jene mit strengen Datensicherheitsregeln wichtig ist. Die Studie kommt zu dem Schluss, dass diese Methode die Zellzählung demokratisiert, indem sie die finanziellen und technischen Barrieren beseitigt, die eine genaue, automatisierte Zählung für viele kleinere Labore bisher unerreichbar gemacht haben. Durch die Nutzung des Gitters, das bereits auf dem Glasobjektträger vorhanden ist, verwandelt das System ein Standardlaborgerät in ein leistungsfähiges, präzises und erschwingliches Werkzeug zur Messung des Lebens auf zellulärer Ebene.