CountAnywhere: frugal cell counting and viability from smartphone hemocytometer photos

生細胞を培養するほぼすべての研究所において、日常的かつ極めて重要な作業が毎日行われています。それは、細胞の数を数えることです。研究者が、ある薬が腫瘍にどのように影響するか、あるいはウイルスが組織にどのように感染するか、あるいは幹細胞がいかにして新しい臓器へと変化するかを研究する前に、彼らは正確にどれだけの数の細胞があり、そのうちのいくつがまだ生きているのかを知っておかなければなりません。数十年にわたり、この作業はヘモサイトメーターと呼ばれるガラス製のスライドを用いて行われてきました。これは、その表面に刻まれた格子の上に、液体の小さな一滴を保持するものです。科学者はこのスライドを顕微鏡の下に置き、接眼レンズを覗き込み、格子のマス目の中にある細胞を一つずつ手作業で集計します。これは、人間の目と、数える人の忍耐力に完全に依存した、遅くて退屈なプロセスです。人間は疲れたり気が散ったりするため、二人の異なる科学者が同じ細胞の滴を数えたとしても、異なる数値が出てしまうことがあります。この問題を解決するために、現在多くの研究室では、細胞を数えてくれる高価な自動化装置を購入していますが、これらの装置は数千ドルの費用がかかり、サンプルごとに特別な使い捨てスライドを必要とするため、時間の経過とともに多大なコストがかさむことになります。

メリーランド大学医学部の研究チームは、高価な装置も特別なスライドも必要としない、この問題に対処するための新しい方法を開発しました。彼らは、標準的なスマートフォンを細胞カウンターに変える「CountAnywhere」という、無料のブラウザベースのツールを作成しました。このシステムは、顕微鏡越しにガラススライドの写真を撮り、スライドに既に刻まれている格子を利用して計算を行う仕組みです。専用の器具に頼る代わりに、ソフトウェアは格子線を定規として使用して面積を測定し、画像が十分に鮮明であるかを確認した上で、写真内のすべての細胞を自動的に識別してカウントします。また、細胞が周囲の環境と比較してどの程度明るいか、あるいは暗いかをチェックすることで、それぞれの細胞が生きているか死んでいるかを判断します。このアプローチは、高価な機器や使い捨ての材料の必要性を排除し、顕微鏡とスマートフォンさえあれば、あらゆる研究室で正確な細胞カウントを可能にします。

研究者たちは、科学者が細胞を見ている時にすでに撮影している普通の写真で動作するように、このシステムを構築しました。ユーザーが標準的なガラススライドの格子部分の写真を4枚アップロードすると、ソフトウェアはまず画像内の格子線を見つけ出します。ソフトウェアはこれらの線を使用して、写真の傾きや歪みを補正し、電話が顕微鏡からどの程度離れていても、あるいはどのような種類のスマートフォンを使用しても、測定される面積が正確に1平方ミリメートルになるようにします。このステップは、単純なスナップショットを精密な測定ツールへと変えるために極めて重要です。画像が補正された後、ソフトウェアは領域をスキャンして細胞を探します。初期のテストでは、画像内の物体を見つけるために設計された一般的なコンピュータプログラムは、特に細胞が密集していたり、背景と非常によく似ていたりする場合に、多くの細胞を見落としてしまいました。これを解決するために、研究者たちは5種類の異なる細胞の画像を用いてソフトウェアを特別に訓練し、ヘモサイトメーター内でのこれらの細胞の見え方の例を数千件示しました。このトレーニングにより、ソフトウェアは高い精度で細胞を認識できるようになり、混雑した条件下でもほぼすべての細胞を見つけ出すことが可能になりました。

ソフトウェアが細胞を特定した後、それらが生きているか死んでいるかを判断します。この手法では、科学者はしばしば、損傷した細胞膜を持つ細胞（死細胞）にのみ入り込む青色の染料を細胞に混ぜます。生存細胞は明るくクリアなままですが、死細胞は濃い青色に変わります。ソフトウェアは各細胞の明るさを測定し、それをすぐ隣の液体の明るさと比較します。もし細胞が周囲よりも暗ければ、プログラムはそれを死細胞とマークし、明るければ生存細胞とマークします。このルールは単純であり、異なる種類の細胞に対する複雑な計算や調整を必要としません。研究者たちが5つの異なる細胞株を用いてこの手法を検証したところ、人間の専門家と同等のレベルの精度で、生存細胞と死細胞を正しく識別できることが分かりました。

この新しい手法が実世界でどの程度うまく機能するかを確認するため、研究者たちは人間の手によるカウントおよび市販の自動化装置によるカウントと比較を行いました。彼らは128の異なる細胞サンプルのセクションを分析しました。その結果、スマートフォンアプリは、人間のカウンターよりも真のカウント数に近い一致を示しました。人間が手作業で細胞を数えた場合、サンプル中の細胞数が増えるにつれて細胞を見落とす傾向があり、実際に存在する数よりも少ないカウント結果となりました。しかし、アプリはこのミスを犯しませんでした。サンプルがまばらであっても非常に密集していても、アプリは同じ割合で細胞をカウントしました。速度の面でも、アプリは大幅に高速でした。サンプルの全カウントにアプリは約50秒を要しましたが、手作業では平均122秒かかりました。市販の装置は約17秒と最も速かったものの、専用の器具とサンプルごとの使い捨てスライドを必要としました。一方、アプリは再利用可能なガラススライドとスマートフォンのみを使用します。

研究者たちは、異なる種類の細胞や、AndroidおよびAppleを含む異なる種類のスマートフォンモデルを用いて、複数のセッションを通じて知見を検証しました。彼らは、画像にピントが合っており、格子が見えている限り、システムが信頼性を持って動作することを確認しました。また、ソフトウェアは研究室内のローカルコンピュータ上で実行できるため、インターネット接続さえ不要であることも指摘しています。これは、遠隔地にある研究室や、厳格なデータセキュリティ規則を持つ研究室にとって重要です。本研究は、正確な自動カウントを困難にさせてきた財務的および技術的な障壁を取り除くことで、細胞カウントを民主化することを結論付けています。ガラススライドに既に存在する格子を利用することで、このシステムは標準的な研究用機器を、生命のレベルを測定するための強力で精密、かつ手頃な価格のツールへと変貌させるのです。