Unfolding of the disease-linked bank vole prion protein E200K in the context of PrPSc propagation

問題提起
病理学的なアミロイド形態（PrPSc）におけるプリオンタンパク質の原子レベルの構造は、並行レジスター型ベータスタック（PIRILBS）として解明されている。しかし、この構造的知見は、プリオンの伝播メカニズムを明らかにすることには至っていない。PrPScは標準的なアミロイドであるため、すでにアンフォールド（展開）されたポリペプチド鎖しかテンプレート化することができない。細胞性プリオンタンパク質（PrPC）の無秩序なN末端ドメイン（~90-120）は容易にPrPScのコンフォメーションを採用できるが、球状の折り畳みドメイン（FD, ~121-231）は、PrPScの表面に直接テンプレート化されることはできない。著者らは、PrPScの「プロクルステスの床（強制的適合を強いる環境）」を受け入れるために、FDがまず部分的にアンフォールドする必要があると提案している。本研究が取り組む具体的な問題は、バンクボレ（bank vole）プリオンタンパク質の疾患関連変異体であるE200K変異体の、初期のアンフォールディング・イベントを理解することである。E200Kはヒトにおける家族性プリオン病を引き起こす最も一般的な変異であり、自発的なPrPSc生成に対して極めて高い能力を付与しているが、その折り畳みドメインの安定性は野生型（wt）と比較してわずかに低い程度である。本研究は、BVPrPC(E200K)の初期アンフォールディング経路が野生型と異なるのか、そしてこれらの違いが変異体の高い自発的転換能を説明できるのかを判断することを目的としている。

方法論
本研究では、野生型およびE200K型の両方の組換えバンクボレPrP(90-231)を用いた。研究者らは、熱によるアンフォールディングと動態的挙動をマッピングするために、多角的な生物物理学的アプローチを用いた：

• 円二色性（CD）分光法： ファーUV CD分光法を用いて、全域的な熱アンフォールディングをモニタリングし、加熱および冷却時における構造変化の可逆性を評価した。
• 溶液NMR分光法： 高分解能の1H-15N HSQCスペクトルを温度範囲（15–75 °C）にわたって記録し、残基特異的な構造変化を追跡した。
• 動態解析： 「可動性」の高い領域（初期アンフォールディングが起こりやすい領域）を特定するため、15–45 °Cの範囲で3つの特定のNMR手法を適用した：
  • 15N リラクゼーション： ピコ秒からミリ秒のタイムスケールにおける運動を特徴付けるため、R1、R2、およびヘテロ核NOEを測定した。
  • 温度係数（Tc）： 水素結合の安定性を評価するため、アミドプロトンの化学シフトドリフトを分析した。
  • 複合化学シフト差（CCSD）： 化学シフトの変化の温度に対する線形性を評価し、代替的な高エネルギーコンフォメーションをサンプリングしている残基を検出した。
• オリゴマー解析： 75 °Cへの加熱後に形成されるオリゴマー種を特徴付けるために、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）およびネガティブ染色透過電子顕微鏡（TEM）を用いた。
• 自発的転換アッセイ： シードが存在しない条件下（ガラスビーズとデキストラン硫酸を使用）で、タンパク質ミスフォールディング・シェイキング増幅法（PMSA）を行い、両変異体がPK耐性PrP（PrPres）を自発的に生成する能力をテストした。

主な結果

• 熱安定性と可逆性： E200K変異体の融解温度（Tm）は約61.3 °Cであり、野生型（65.6 °C）よりも約4 °C低かった。両タンパク質とも45 °Cまでは可逆的なアンフォールディングを示したが、E200K変異体は75 °Cへの加熱後、野生型と比較して不可逆性が低かった。変異体の加熱後のCDおよびNMRスペクトルは、二次構造およびピーク強度の永久的な喪失が少ないことを示した。
• 初期アンフォールディング経路： NMRによる動態解析（Tc、リラクゼーション、およびCCSD）により、BVPrPC(E200K)の初期アンフォールディングイベントは野生型と本質的に同様であることが明らかになった。両変異体において、無秩序なテイルに隣接するセグメント（~121-140）、具体的にはβ1ストランドとその隣接するコイルを含む領域が、最初にアンフォールドする可能性が最も高い領域であった。
• 動態の細部： 主要なアンフォールディング経路は類似していたものの、微妙な違いが観察された：
  • E200K変異体は、非線形のCCSDを示す残基が少なかった（野生型では16に対し、E200Kでは9）。これは、折り畳みドメインが潜在的により剛直、あるいはより複雑ではないコンフォメーション景観を持っていることを示唆している。
  • 変異体におけるβ1/β2アセンブリは、野生型よりも不安定性が低いようであり、これらの領域における非線形残基も少なかった。
  • 変異体は、75 °Cへの加熱後、野生型と比較して有意に少ない可溶性オリゴマー（~12量体以上）を形成した（野生型の全面積の41%に対し、変異体は14%）。
• 自発的転換： シードを用いないPMSAアッセイにおいて、E200K変異体は、野生型の切断型タンパク質よりも高い自発的ミスフォールディング傾向を示さなかった。両変異体は、第1および第2パスにおいて、同様の割合（それぞれ2/8および3/8のレプリケート）で自発的に転換した。

意義および主張
本論文は、E200K変異体が生体内でPrPScを自発的に生成する極めて高い能力を持つ理由は、折り畳みドメインの根本的に異なる、あるいはより容易な初期アンフォールディング経路によるものではない、と主張している。むしろ、初期アンフォールディング経路は保存されており、~121-140セグメントが両者のケースにおける最初の「呼吸（breathing）」ホットスポットとして機能している。

著者らは、遺伝性プリオン病におけるE200K変異体の高い浸透率が、折り畳みドメインの固有の熱力学的不安定性や特異なアンフォールディングメカニズム以外の要因に起因している可能性があると示唆している。彼らは、変異による表面静電ポテンシャルの影響（正電荷と負電荷のパッチの形成）が、アニオン性共因子や他のPrPC分子との相互作用を促進し、隔離されたタンパク質のアンフォールディングキネティクスや、特定のPMSA条件下での自発的ミスフォールディング能には反映されないものの、細胞内環境における自発的転換の速度論的障壁を下げているのではないかと考えている。本研究は、自発的なシードなしの転換メカニズムと、PrPScテンプレートによる伝播の間の根本的な違いを強調しており、E200K変異体のシード不在下での挙動は、必ずしもシードが存在する場合の挙動を予測するものではないことを示している。