A Lacticaseibacillus paracasei postbiotic rescues glucose-impaired serotonergic signalling in C. elegans and is antagonised by unmetabolised folic acid

技術要約：Lacticaseibacillus paracasei 由来のポストバイオティクスが C. elegans におけるグルコースによるセロトニン作動性シグナル伝達不全を救済し、未代謝葉酸によって拮抗される

問題提起
葉酸強化は、世界的に神経管閉鎖障害を減少させることに成功してきたが、高血糖やビタミンB12不足を併発している集団への影響については依然として不明である。これらの集団では、過剰な葉酸が循環中に未代謝葉酸（UMFA）の蓄積を引き起こす可能性がある。疫学データは、糖尿病患者における高レベルの葉酸が死亡率およびニューロパチー（神経障害）と相関することを示唆しているが、この栄養状態と細胞機能不全を結びつける分子メカニズムは未定義である。具体的には、グルコースストレス、葉酸種、および神経機能の間の相互作用を、追跡可能なモデル系において解明する必要がある。

方法論
本研究では、Caenorhabditis elegans を用いて、低血糖症と葉酸過剰の収束をモデル化した。研究者らは、カルシウムシグナリング、神経突起の形態、および産卵行動において重要な役割を果たすセロトニン作動性ニューロン、特に神経分泌運動ニューロン（NSM）および雌への特異的ニューロン（HSM）に焦点を当てた。

• モデル系: 野生型 C. elegans および GCaMP（カルシウムイメージング用）および mScarlet（神経突起形態測定用）を発現するレポーター株を用い、以下の様々な細菌食で維持した：E. coli OP50（コントロール）、生きた Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans 株 AV47、生きた Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、およびこれら菌株の細胞不含ライセート（CFL）。
• ストレス条件: グルコース毒性を誘発するために、慢性的な2%食事グルコースに曝露させた。
• 介入: 生きた L. paracasei AV47 およびその CFL の救済効果を検証した。能動的な成分を特定するため、著者らは以下を用いた：
  • 化学的摂動: UMFA、10-ホルミル-テトラヒドロ葉酸 (10-formyl-THF)、S-アデノシル-L-メチオニン (SAM)、S-アデノシル-L-ホモシステイン (SAH)、メトトレキサート (MTX)、およびスルファメトキサゾール（DHPS阻害剤）。
  • 物理的摂動: 加齢させた CFL（4°Cで2週間）およびスルファメトキサゾール処理されたプロデューサー培養物。
• アッセイ:
  • カルシウムイメージング: GCaMP7 を用いた NSM カルシウム一過性変化のリアルタイム測定。
  • 形態測定: NSM の腹側および背側神経突起の長さの手動トレース。
  • 行動アッセイ: 子宮内孵化（IUH）率および急性産卵刺激。
  • 代謝アッセイ: 残留培地グルコース量および Sudan III 染色による腸管脂質蓄積。
  • ストレス耐性: 急性過酸化水素曝露下での生存率および体屈曲頻度（運動性）。
• 生化学的分析: 微生物学的アッセイにより、細菌上清中の葉酸、メチルコバラミン、およびピリドキサール-5-リン酸を定量した。

主要な貢献および結果

1. セロトニン作動性シグナルの救済: 慢性的な食事グルコースは NSM カルシウム一過性変化を抑制した。生きた L. paracasei AV47 およびその CFL は、カルシウムシグナリングを正常レベルに回復させた。この効果は可溶性の分泌画分に局在しており、CFL が生きた細菌なしで救済を再現したことから確認された。
2. 能動的なエフェクターの特定: 以下の条件によって救済活性は消失した：
   • CFL の加齢（不安定な成分の存在を示す）。
   • ディヒドロプテロアート合成酵素（DHPS）を阻害するスルファメトキサゾールの存在下でのプロデューサーの培養。
   • L. delbrueckii への置換（同様の補因子プロファイルを持たない）。
   • 逆に、純粋な 10-formyl-THF は、同等の規模で救済を再現した。
   • 結論: 能動的な成分は、機能的に 10-formyl-THF として特定された、不安定な還元型葉酸である。
3. 条件的拮抗作用としての UMFA: 中心的な知見は、UMFA が高グルコースに同時に曝露された場合にのみ、救済を拮抗したことである。グルコースが存在しない場合、UMFA は影響を及ぼさなかった。これは、FOLR-1 葉酸受容体における細菌由来 10-formyl-THF との競合的な置換を示唆しており、この効果は高血糖による酸化ストレスによってメチル化経路が制約されている時にのみ顕在化する。
4. 構造および行動の保持:
   • 神経突起の構築: 初期幼虫期（L3以前）における高グルコース曝露は、NSM 神経突起の不可逆的な短縮を引き起こした。L. paracasei AV47（およびその CFL）はこの条件下で神経突起の長さを保持したが、外因性の葉酸は保持できなかった。
   • 生殖出力: 細菌食は子宮内孵化（HSN 機能不全の兆候）を減少させ、急性産卵を刺激した。この刺激は、プロデューサーのスルファメトキサゾール前処理によって消失し、カルシウム救済と同じ DHPS 依存性経路に結び付けられた。
5. 代謝およびレドックスの利益:
   • 炭素フラックス: L. paracasei AV47 CFL は残留培地グルコースおよび腸管脂質蓄積を減少させ、脂質蓄積から酸化利用へのシフトを示唆した。この効果はメチルトランスフェラーゼ阻害（SAH）には耐性があったが、一炭素サイクル阻害剤（MTX、UMFA）には感受性を示した。
   • 酸化ストレス: 両方の生きた L. paracasei AV47 およびその CFL は、コントロールと比較して、急性過酸化水素ストレスに対する約7倍の生存優位性を付与した。
   • 運動性: ポストバイオティクスは自発的な体屈曲率を倍増させ、神経筋機能の改善を示した。

意義および主張
著者らは、これらの知見は、定義された微生物由来の補因子活性（具体的には L. paracasei によって生成される 10-formyl-THF）が、葉酸によって悪化したグルコース毒性に抗し得るという証拠であると解釈している。本研究は、合成ビタミンである UMFA が、高血糖による酸化ストレスによって一炭素フラックスが狭まった代謝コンテキストにおいて、特異的に負の影響を与える「負債」として機能すると仮定している。これは、FOLR-1 受容体における還元型葉酸との競合的な不利を生じさせる。

論文は、ポストバイオティクス（CFL）がセロトニン作動性カルシウム活性の強力なアゴニストとして作用し、その効果が神経突起の完全性、生殖行動、代謝フラックス、およびストレス耐性を含む下流の生理学的出力へと一貫して伝播することを主張している。著者らは、10-formyl-THF が、特に UMFA への曝露と高血糖が併存する条件下で、哺乳類系においてもテストすべき、微生物由来のデリバラブルなエフェクターである可能性を示唆している。彼らは、この活性が精製された試薬ではなく、分泌されたポストバイオティクスによって提供されることを強調しており、これは再現可能な製剤への道を提供している。

著者らは、C. elegans モデルはヒトの神経構造を完全に再現できないため、翻訳にはより生理学的に関連性の高い系での検証が必要であることを認め、限界についても述べている。彼らは、葉酸強化の臨床的な謎を解明したと主張しているのではなく、葉酸の化学形態（還元型細菌ビタミン vs 合成 UMFA）と代謝コンテキスト（グルコースストレス）が、結果を決定する重要な要因であるという、候補となるメカニズムの枠組みを提示している。