Distinct structural mechanisms drive gain-of-function activation of TMEM16E in gnathodiaphyseal dysplasia

技術要約：顎頷き解離性異形成（Gnathodiaphyseal Dysplasia）におけるTMEM16Eの機能獲得型活性化を駆動する異なる構造メカニズム

問題提起
TMEM16E（ANO5）は、筋肉および骨の恒常性に不可欠な、Ca²⁺活性化リン脂質スクランブラーゼおよびイオンチャネルである。TMEM16E変異は、通常、機能喪失（LoF）を介した肢帯型筋ジストロフィー12型（LGMDR12）およびミオシチ筋ジストロフィー3型（MMD3）を引き起こすが、機能獲得（GoF）表現型を伴う常染色体優性遺伝の顎頷き解離性異形成1型（GDD）とも関連している。その生理学的重要性にもかかわらず、TMEM16Eの活性化の構造的基盤、およびGDD変異が構成的な活性を誘導する具体的なメカニズムは不明であった。さらに、他のTMEM16ファミリーメンバーは異なる活性化メカニズム（例：オープングルーブ型またはX字型グルーブ型）を示すが、TMEM16Eがどのメカニズムを採用しているのか、また疾患変異がこのプロセスをどのように変化させるのかは不明であった。

手法
本研究では、構造生物学、機能アッセイ、および計算モデリングを組み合わせた多角的なアプローチを用いた：

• タンパク質精製および機能アッセイ： ヒトTMEM16E（hTM16E）を精製し、プロテオリポソームに再構成した。脂質スクランブリング活性は、NBD標識リン脂質を用いたジチオナイトベースのアッセイにより、Ca²⁺の存在下および非存在下でのトランスロケーション速度を定量化した。
• クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）： 野生型（WT）hTMEM16Eのapo状態およびCa²⁺結合状態、ならびに2つのGDD関連GoF変異体（G503EおよびR582I）の構造を決定した。
• 細胞ベースの機能アッセイ： HEK293T細胞（TMEM16Fノックアウト）にWTまたは変異型hTM16Eを過剰発現させ、イオノマイシンによるCa²⁺上昇時のホスファチジルセリン（PS）外方への露出を定量化するフローサイトメトリーアッセイを用いた。
• 分子動力学（MD）シミュレーション： コンフォメーション転移を探索するために、全原子MD（aaMD）および適応的アンサンブルMD（aeMD）を実施した。得られたコンフォメーションにおける脂質スクランブリング能を評価するために、粗視化MD（cgMD）シミュレーションを利用した。

主な結果

1. WT hTM16Eの特異的な構造的特徴：

   • 他の多くのTMEM16ファミリーメンバーとは異なり、apo hTM16Eは直線的なTM6ヘリックスと、あらかじめ形成された直交的Ca²⁺結合部位（S1およびS2）を有している。
   • Ca²⁺結合は、膜貫通ドメインに有意な構造変化をもたらさない。すなわち、apo構造とCa²⁺結合構造はほぼ同一である（Cα r.m.s.d. ~1.0 Å）。
   • 飽和状態のCa²⁺（1 mM）においても、S2直交的部位の占有率は部分的である。
   • 機能面では、hTM16EはCa²⁺不在下でも高い基底スクランブリング活性を示し、Ca²⁺飽和による活性上昇はわずか（約10倍）であり、他のファミリーメンバーで見られる200倍を超える上昇とは対照的である。

2. GDD変異体のメカニズム：

   • R582I： TM5-TM6細胞外ループに位置するこの変異は、R582、D342、およびTM1-TM2ループを含む保存された相互作用ネットワークを破壊する。この破壊は細胞外ループの再編成を引き起こし、予想に反して、S2直交的Ca²⁺結合部位の占有率を高める。機能的には、R582Iは直交的部位変異によって引き起こされる活性の消失をレスキューするため、そのGoF表現型はCa²⁺結合親和性の向上によって駆動されていることが示唆される。
   • G503E： TM4の細胞外端に位置するこの変異は、TM3-TM4界面を破壊する。電荷を持つグルタミン酸の導入はステリッククラッシュ（立体障害）を引き起こし、TM3のキンク（折れ曲がり）と、グルーブからTM4の側方へのスライドを誘発する。この構造変化は、TMEM16Fの活性化過程で見られる中間状態を模倣している。

3. 活性化メカニズムと脂質スクランブリング：

   • MDシミュレーションにより、Ca²⁺結合型のWTクローズドグルーブ状態は安定しており、不活性であることが明らかになった。
   • G503E変異体は、TM4がTM6に沿ってスライドする、TMEM16Fの活性状態と同様の「X字型」グルーブコンフォメーションへと容易に転移する。
   • 粗視化MDシミュレーションにより、このX字型コンフォメーション（G503EaeMD）は強固な脂質スクランブリングを媒介することが確認されたが、WTおよびR582I変異体はこの特定の活性状態を同様には採用しない。
   • これは、hTM16Eが、ER常在性のTMEM16Kに見られるオープングルーブメカニズムではなく、TMEM16Fと共通のメカニズムであるX字型グルーブの外で脂質をスクランブルすることを示している。

意義および主張
本論文は、hTM16Eの活性化の構造的基盤、および表現型が収束する（GDDの）異なる変異のメカニズムを解明したと主張している。主な貢献は以下の通りである：

• メカニズムの多様性： 本研究は、高い配列相同性にもかかわらず、TM16Eが、Ca²⁺結合が主要な構造変化を駆動せず、S2部位が部分的に未占有のままとなる独自の活性化経路を利用していることを示した。
• 分岐するGoF経路： GDD変異であるG503EとR582Iが、同様の病理学的表現型（構成的なスクランブリング）を生じさせる一方で、根本的に異なる構造メカニズムを通じて作用することを確立した。具体的には、G503Eは界面破壊を通じてX字型活性状態を優先させ、R582Iはアロステリックに作用してS2 Ca²⁺占有率を高める。
• 治療への示唆： これらの経路を区別することで、著者らは、GDDに対する標的治療介入は変異特異的である必要があると示唆している。なぜなら、G503Eの界面破壊メカニズムとR582Iの結合親和性メカニズムの両方に対処できる単一の戦略は存在しないからである。
• 局在 vs メカニズム： 本知見は、細胞内局在（ERか細胞膜か）が活性化メカニズムを決定するという仮定に疑問を投げかけるものである。ERに局在するTMEM16Eは、ER常在性のTMEM16Kとは異なる、細胞膜に局在するTMEM16Fと同様のX字型活性状態を採用していることを示した。