The conserved β-hairpin of the SUI1 domain is a dual-function structural module governing translation initiation and ribosome recycling in yeast

技術要約：酵母の翻訳リサイクルにおけるSUI1ドメインの保存されたβヘアピン

問題提起
真核生物の翻訳において、リボソームのリサイクルは、リボソームサブユニットが翻訳サイクルに再参入できるように、終止複合体を解体するために不可欠である。ヘテロダイマーであるMCTS1•DENR（酵母ではTma20p•Tma22p）は主要なリサイクル因子であるが、その正確な分子メカニズムおよび特定の構造ドメインの機能的重要性が完全には解明されていない。DENR/Tma22pは、翻訳開始因子eIF1/Sui1pと構造的に相同なC末端SUI1ドメインを含んでいる。このドメインは、eIF1による開始コドンの選択において重要な、保存された正電荷を持つβヘアピンループ（ループ1）を特徴としている。しかし、リボースのリサイクルおよび翻訳再開始の文脈における、この特定のループおよびSUI1ドメインの機能的な必要性は、遺伝学的または生化学的には定義されていなかった。さらに、再開始におけるリサイクル因子の役割に関して、酵母と哺乳類システムの間には相違が存在するため、Saccharomyces cerevisiaeにおけるTma20p、Tma22p、およびホモログであるTma64p（eIF2D）の寄与を明確に区別する必要があった。

方法論
著者らは、これらのメカニズムを解明するために、S. cerevisiaeを用いた一連のin vivoレポーターアッセイと標的変異導入を組み合わせた手法を用いた：

1. レポーターシステム： 再開始効率を定量化するために、2種類の二シストロン性ルシフェラーゼ・レポーターを構築した：
   • uORF_rein： 5' UTR内の短い5コドン上流オープンリーディングフレーム（uORF）に続く「正当な」調節的再開始をモデル化している。
   • mORF_rein： 3' UTR内のフルレングスコーディング配列（CDS）に続く「不当な」再開始をモデル化している。
   • 再開始率は、非特異的な翻訳効果を最小限に抑えるため、コントロール構築物および野生型（wt）株に対して正規化された、Nano-luciferase (Nluc) と Firefly luciferase (Fluc) の活性比として計算された。
2. 遺伝子株： TMA20、TMA22、およびTMA64に対する一重、二重、および三重ノックアウト（KO）株を作成した。
3. 変異導入および相補： tma64Δtma22Δ 二重KO株に対し、以下の様々なTMA22変異体を用いて相補を行った：
   • 正電荷を持つβヘアピンループ1における点置換（KRK108AEAおよびK110E）。
   • ドメイン欠失：N末端ZnBDの除去（L2-E90del）またはC末端SUI1ドメインの除去（L95*）。
   • Tma22pのN末端ZnBDとSui1p/eIF1のSUI1ドメインを融合させたキメラタンパク質。
4. 解析： ルシフェラーゼ活性は細胞溶解液中で測定され、統計的有意性は、log₂変換された比率とHolm-Bonferroni補正を用いたz検定によって決定された。

主な結果

1. Tma20p•Tma22pヘテロダイマーの優位性： KO株の系統的な解析により、Tma20p•Tma22p複合体は、Tma64pと比較して再開始を抑制する上で支配的な役割を果たすことが明らかになった。単独のTMA64欠失は最小限の影響しか与えなかったが、tma20Δtma22Δ二重KOは上昇した再開始を示し、三重KO（tma64Δtma20Δtma22Δ）は最も高いレベルを示した。注目すべきことに、単独のTMA20欠失は単独のTMA22欠失よりも顕著な再開始の上昇を引き起こしたことから、Tma20pがより重要な構成要素であるか、あるいはTma22pが他の因子によって部分的に補償され得るsことが示唆された。
2. βヘアピンループ1の必須性： Tma22pのSUI1ドメインの正電荷を持つβヘアピンループ1における点変異（KRK108AEAおよびK110E）は、リサイクル能の完全な喪失をもたらした。これらの変異体を保持する株は、tma22Δ欠失株と同等またはそれ以上の再開始率を示し、これは非機能的な因子が存在することが、その不在よりも有害である可能性を示している。
3. SUI1ドメイン欠失に関する予期せぬ役割： 点変異による深刻な影響とは対照的に、Tma22pのSUI1ドメインの完全な欠失（L95*）は、Tma22pの全欠失と比較して有意に低い再開始率をもたらした。これは、SUI1ドメインの機能が他の細胞成分、おそらくeIF1/Sui1pによって部分的に補償され得ることを示唆している。
4. eIF1による機能的置換： Tma22pのSUI1ドメインを酵母eIF1（Sui1p）のSUI1ドメインで置換したキメラタンパク質は、tma22Δ株における再開始の抑制を部分的に回復させた。これは、eIF1のSUI1ドメインが、40Sリサイクル中のTma22pの対応するドメインの代わりに機能的に置換できることを示している。

意義および主張
本論文は、DENR/Tma22pのSUI1ドメインにおける正電荷を持つβヘアピンループ1が、酵母におけるリボソームのリサイクルおよび翻訳再開始の決定的な要因であることを確立している。これらの知見は、翻訳開始とリサイクル機構の間の驚くべき機能的平行性を浮き彫りにしており、共通のSUI1構造スキャフォールドが、翻訳サイクルの異なる段階を制御するために進化的に適応されたことを示している。

著者らは、Tma20p•Tma22pヘテロダイマーが、酵母におけるuORFおよびメインORFの両方のストップコドンにおける40Sリサイクル能の主要な供給源であり、Tma64pに対して支配的な役割を果たすと結論づけている。さらに、本研究は、MCTS1/Tma20pが、共通の構造スキャフォールドから派生した二つの特殊化された因子であるDENR/Tma22pまたはeIF1/Sui1pのいずれとも、細胞の文脈に応じて無差別に作用し得る可能性を提起している。これらの結果は、保存された構造要素がいかにして翻訳サイクルの異なる段階のために再利用されるかについてのメカニズム的洞察を提供し、βヘアピンループ内の特定の残基が因子の生理学的機能にとって不可欠であることを示唆している。