USP13 stabilizes prohibitin 1 to support CD14 turnover and restrain TLR4-NLRP3 inflammatory signaling in sepsis

技術要約：USP13はProhibitin 1を安定化させることで、敗血症におけるCD14のターンオーバーを支持し、TLR4-NLRP3炎症シグナル伝達を抑制する

問題提起
敗血症は感染に対する宿主応答の調節不全を伴い、過剰な自然免疫の活性化が全身性炎症と臓器機能不全を引き起こす。ユビキチン・プロテアソーム系はタンパク質の安定性と炎症シグナル伝達を制御しているが、敗血症における受容体近傍のエンドトキシン感知（具体的にはCD14/TLR4軸）を制御する特定のプロテオスタシス機構は、依然として十分に解明されていない。先行研究では、Prohibotin 1 (PHB1) が、TRIM21依存的なCD14のユビキチン化および分解を促進するスキャフォールドとして機能し、それによってリポ多糖（LPS）への応答性を減衰させることが確立されている。しかし、全身性炎症においてPHB1自体がどのようにタンパク質レベルで維持されているのか、あるいは上流のプロテオスタシス制御の崩壊が、どのようにPHB1依存的なCD14のターンオーバーを損なうのかについては不明であった。

方法論
本研究では、ヒト臨床データ、生化学的アッセイ、および補完的なin vivoモデルを組み合わせたマルチモーダルなアプローチを用いた：

• ヒトトランスクリプトミクス： 公開されている末梢血トランスクリプトームデータ（GSE95233; 敗血症患者51名、コントロール22名）を、好中球およびT細胞の存在量を調整して解析した。さらに、臨床コホート（敗血症10名、敗血症性ショック10名、非感染コントロール10名）から前向きに収集された末梢血単核細胞（PBMC）を解析し、これには8名の敗血症患者からの対応する縦断的サンプリング（Day 0/Day 7）も含まれる。
• 細胞モデル： ヒト肺線維芽細胞（WI-38）、肺腺癌細胞（A549）、および骨髄系細胞株（THP-1, U937）を用い、ノックダウン（shRNA）、過剰発現、および触媒死変異体（C345A）を介してUSP13の機能を調査した。アッセイには、生存率（CCK-8）、ROS測定、ウェスタンブロッティング、共沈降（Co-IP）、GSTプルダウン、およびユビキチン化アッセイが含まれる。
• 動物モデル： 2つのマウス敗血症モデルを利用した：
  1. エンドトキセミア： LPS誘発性の全身性炎症。
  2. 多菌種敗血症： 標準的な抗菌薬および輸液サポートを伴う、ヒト糞便スラリー誘発性の腹膜汚染および感染（PCI）モデル。
• 遺伝学的操作： Usp13およびPhb1のin vivoでのノックダウン（shRNA）および過剰発現のために、アデノ随伴ウイルス（AAV9）ベクターを使用した。経路の階層関係を確立するために、相反的なエピスタシス実験（Usp13欠損によるPHB1過剰発現でのレスキュー、およびその逆）を実施した。
• 治療的介入： 組換えヒトPHB1（rhPHB1）の遅延投与を、Usp13欠損エンドトキセミアにおいてテストした。

主な結果

1. 敗血症におけるUSP13の抑制： USP13の発現は、公開されている敗血症のトランスクリプトームおよび患者のPBMCにおいて有意に減少していた。これは好中球の拡大を調整した後でも観察された。縦断的解析により、生存患者ではDay 7までにUSP13レベルが部分的に回復することが示された。
2. USP13-PHB1相互作用： USP13はPHB1に直接結合する。USP13は、ポリユビキチン化を制限することでPHB1を安定化させ、それによってプロテアソームによる分解を防ぐ。これにはUSP13の触媒活性が必要であり、C345A変異体はPHB1を安定化させられなかった。ユビキチン化アッセイは、全体的なポリユビキチン化を測定したものであり、部位特異的なものではなかった。
3. CD14/TLR4の制御： USP13-PHB1軸はCD14のターンオーバーを制御する。USP13の喪失はPHB1の減少を招き、それがCD14のK48結合型ユビキチン化を減弱させる（特定のCD14アッセイにより評価）。その結果、CD14およびTLR4が蓄積し、NLRP3インフラマソームのプライミングの強化、酸化ストレスの増大、および炎症性サイトカイン（TNF-α, IL-6, IL-18, IL-1β）の放出上昇につながる。
4. In Vivoにおける病原性： マウスにおいてUsp13またはPhb1を欠損させると、LPS誘発性エンドトキセミアおよび多菌種敗血症が悪化し、死亡率の上昇と全身性炎症を招いた。
5. 相反的エピスタシスとレスキュー：
   • 階層： PHB1の回復は、Usp13欠損によって引き起こされる炎症および致死的表現型を救済した。逆に、Usp13の過剰発現はPhb1の喪失をバイパスできなかったため、PHB1はUSP13の下流に位置することが示された。
   • メカニズム的レスキュー： Usp13欠損マウスにおいて、PHB1の回復はK48結合型CD14ユビキチン化を回復させ、CD14/TLR4の存在量を減少させた。
   • 治療的概念実証： 遅延投与された組換えPHB1（LPS投与後4時間および30時間）は、Usp13欠損エンドトキセミアにおける死亡率と炎症を減少させた。

意義および主張
本論文は、敗血症における受容体近傍の自然免疫シグナル伝達を制約する上流のチェックポイントとして機能する、USP13-PHB1-CD14プロテオスタシス軸を特定している。本研究は、USP13がPHB1の安定性を維持し、それがCD14のユビキチン依存的なターンオーバーに不可欠であるという、新たなメカニズムを定義すると主張している。CD14の分解を維持することにより、この軸はCD14/TLR4複合体の利用可能性を制限し、NLRP3関連の炎症シグナル伝達を抑制する。

著者らは、本研究が、このチェックポイントの下流成分であるPHB1が（遺伝的または組換え的な手段によって）機能的に回復可能であるという概念実証的証拠を提供するものであるが、PHB1補充を臨床治療として確立するものではないことを強調している。知見は、ヒトのトランスクリプトーム観察と生化学的メカニズムおよびin vivoモデルを結びつけるメカニズム的な洞察として提示されており、USP13が敗血症に関連するプロテオスタシスの重要な調節ノードであることを浮き彫りにしている。また、本研究は、前向き臨床コホートの規模が限定的であることや、細胞株および単一ドナーの糞便スラーリーを使用しているといった限界を認めており、これらの知見をより広範なドナー背景や主要な免疫細胞において検証するために、今後の研究が必要であることを示唆している。