Detection, Genetic Characterization, and Evolutionary Analysis of Jingmen Tick Virus in Ticks from Border Regions of Yunnan Province, China

技術要約：中国雲南省の境界地域におけるダニからのジンメン・ティック・ウイルス（JMTV）の検出、遺伝学的特性解析、および進化分析

問題提起
ジンメン・ティック・ウイルス（Jingmen tick virus: JMTV）は、Flaviviridae科Flavivirus属に属する、新興の分節化されたプラス鎖RNAウイルスである。古典的なフラビウイルスとは異なり、JMTVは特有の4つのゲノムセグメントを有しており、世界中のダニ、哺乳類、爬虫類から検出されており、中国およびコソボにおいてヒトへの感染が確認されている。その世界的な分布と潜在的な公衆衛生上の脅威にもかかわらず、雲南省（家畜および媒介生物の国境を越えた移動の重要なゲートウェイである）の境界地域におけるJMTVの疫学的データは限られている。本研究は、5つの雲南省境界地域で採取されたダニにおけるJMTVの蔓延率、遺伝的多様性、および進化関係を調査することにより、系統的なサーベイランスの欠落に対処するものである。

方法論

• 試料採取: 2024年5月から2025年8月にかけて、5つの境界地域（瑞麗および騰衝：中国–ミャンマー、西双版納：中国–ミャンマー/ラオス、および meliputi と 文山：中国–ベトナム）において、牛に寄生していたダニ1,035個体を採取した。
• ダニの同定: ミトコンドリアのCOI遺伝子および16S rDNA遺伝子のPCR増幅とシーケンシングを行い、最大尤度（ML）法を用いた系統解析によって種を同定した。
• ウイルスの検出: 特定の遺伝子領域を標的としたRT-qPCRを用いてJMTVをスクリーニングした。陽性のサンプルは、NS1遺伝子を標的としたプライマーを用いたRT-PCRによってさらに検証した。
• 遺伝学的特性解析: 陽性サンプルの全ゲノムに近い配列を取得した。遺伝的相同性、進化関係、および潜在的な組換え（reassortment）事象を世界の参照株と比較して分析するために、4つのゲノムセグメントすべて（NS1–NS4）の系統樹を構築した。
• ウイルスの分離: Vero、BHK-21、C6/36細胞株、および昆明（KM）マウスを用いて、生きたウイルスの分離を試みた。接種した細胞は盲目的（blindly）に3回継代し、接種したマウスについては、臨床症状および組織内のウイルスRNAの有無をモニタリングした。

主な結果

• ダニの種分布: 3種のダニが同定された（Rhipicephalus microplus: 827個体、Haemaphysalis longicornis: 78個体、Haemaphysalis bispinosa: 25個体）。R. microplusが優占種であり、すべての採取地点で見出された唯一の種であった。
• 蔓延率: 全体のJMTV陽性率は70.82%（733/1,035）であった。JMTVはR. microplusからのみ検出された。
  • 地域的変動: 瑞麗（中国–ミャンマー国境）は、末梢（中国–ベトナム国境）の71.33%（102/143）と比較して、有意に高い陽性率93.90%（631/672）を示した（P < 0.001）。
• 遺伝的進化分析:
  • 全ての検出された株は、系統樹におけるアジア参照系統（Clade 1）内にクラスターを形成し、独立した系統を構成した。
  • セグメント間の分岐: 4つのゲノムセグメント（NS1–NS4）は必ずしも同一の枝には集まらず、宿主に関連したクロスオーバーおよびセグメント特異的な進化を示した。
  • NS1: 7つの分離株は、Amblyomma testudinarium由来の参照株J〯M/Yunnan2016と密接にクラスター化した。瑞麗の分離株は、この参照株とサブクレードを共有したが、末梢の分離株は別のサブクレードを形成した。
  • NS2: 多様なクラスター化を示し、末了の分離株の一部は貴州のHaemaphysalis longicornis由来の株に関連しており、瑞麗の分離株はJMTV/Yunnan2016とグループ化した。
  • NS3 & NS4: 4つの末了の分離株と2つの瑞麗の分離株は、Rhipicephalus microplus由来の参照株JMTV/YNTV4と密接に関連していた。残りの1つの瑞麗のNS3分離株は、JMTV/Yunnan2016と同じサブクレードに割り当てられた。
  • 進化に関する結論: データは、「全体的な保存、局所的な多様性」というパターンを示唆しており、コアとなる機能遺伝子は安定している一方で、特定のセグメントが組換えまたは独立した進化を起こしていることを示している。
• ウイルスの分離:
  • 細胞培養: 細胞変性効果（CPE）は観察されなかった。最初の2回の継代における細胞上清からは低コピー数のウイルスRNAが検出されたが、3回目の継代では検出不可能となった。
  • マウスモデル: 接種されたマウスに発熱、体重減少、または臓器腫脹は見られなかった。7日目の血液および組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）のRT-qPCRは陰性であった。
  • 結果: 細胞株およびマウスの両方において、生きたウイルスの分離には失敗した。

主要な貢献

1. 疫学的基盤: 本研究は、中国–ミャンマーおよび中国–ベトナムの境界地域における、牛に関連するダニにおけるJMTVの最初の系統的な蔓延データに関する基盤を確立し、R. microplusをこの地域における主要な媒介者として特定した。
2. 遺伝学的特性解析: 現地の株の全ゲノムに近い配列を提供し、それらがアジアのクレードに属しながらも、独自の局所的にクラスター化した系統を形成していることを明らかにした。本研究は、セグメント特異的なクラスター化を記録しており、JMTVの進化における遺伝的組換えの仮説を支持している。
3. 媒介者の特異性: 調査された動物相の中で、JMTVはR. microمصusによってのみ運ばれていることを確認し、この種が家畜やヒトへのスピルオーバーの可能性がある重要なブリッジベクターであることを強調している。
4. 分離の課題: 細胞およびマウスにおいて生きたウイルスの分離に失敗したことは、JMTVの生物学的な複製要件の特殊性を再確認するものであり、将来の分離研究にはダニ由来の細胞株（例：IRE/CTVM19）がより適していることを示唆している。

意義および主張
著者らは、JMTVが雲南省の境界地域において、現在は過小評価されているものの、信頼できる公衆衛生上の懸念事項であると主張している。中国–ミャンマー国境（瑞麗）におけるR. microplusにおける高い蔓延率は、国境を越えた伝播のリスクを示唆している。これらの知見は、現地の予防・管理戦略を支援するための不可欠な疫学的証拠を提供するものである。

しかし、論文は結論に関して控えめなトーンを維持している：

• サンプリングの限界: 著者らは、全体の陽性率（70.82%）が瑞麗からの大量のサンプル（総サンプルの64.9%）によって大きく偏っていることを認めており、このデータは雲南省全域ではなく、主に瑞麗地域の流行状況を反映していることを意味している。
• 今後の必要性: 著者らは、地域的な推定値を精緻化するためのよりバランスの取れた多地点サンプリングと、吸血したダニの誤同定問題を解決するための改良された形態学的同定手法を求めている。
• 分離: 生きたウイルスの分離の失敗は、研究範囲の失敗としてではなく、ウイルスの特定の複製要件を確認したものとして提示されており、将来のウイルス学的研究にはダニ由来の細胞株が必要であることを指し示している。

要約すると、本研究は、重要な国境地帯におけるJMTVの基礎的な遺伝学的および疫学的プロファイルを提供しており、R. microplusの役割と、ウイルスの伝播ダイナミクスを完全に理解するための継続的かつバランスの取れたサーベイランスの必要性を強調している。