Candida albicans forms azole-resistant liquid-suspension biofilms with distinct characteristics and a potential to aid in dispersal

問題提起
Candida albicans（カンジダ・アルビカンス）は、WHOの「クリティカル・プライオリティ（最優先事項）」に指定されている真菌性病原体であり、医療機器へのバイオフィルム形成は、血流感染症および抗真菌薬耐性の主要な要因となっている。C. albicansのバイオフィルムに関する現在の理解は、主に表面付着型バイオフィルムの研究に依存しており、それらは付着、開始、成熟、分散という標準的な4段階のサイクルに従う。しかし、ホスト内での生存のためにC. albicansが取り得るバイオフィルム形態の全容は、未だ十分に解明されていない。具体的には、表面への付着を必要としない非標準的なバイオフィルム形態のような、液中懸濁状態におけるメカニズムや機能については、十分に理解されていない。本研究は、C. albicansが真にバイオフィルム（bona fide biofilms）を液中懸濁状態で形成できるのかどうか、そしてこれらの構造が、制御、薬物耐性、および分散の観点から表面付着型バイオフィルムとどのように関連しているかという知識の空白を埋めるものである。

方法論
研究者らは、異なる表面条件下におけるC. albicansの増殖を特徴付けるために、多角的なアプローチを採用した：

• 培養モデル： バイオフィルムは、2種類の異なる表面（付着を許容するポリスチレン、および付着しにくい低融点アガロース）上のRPMI-1640培地（pH 7.0）中で培養された。液中懸濁バイオフィルムは、細胞をアガロース表面に播種することで生成され、表面付着型バイオフィルムはプラスチック上に直接播種された。
• 定量化およびイメージング： 増殖は、XTT代謝アッセイと、総増殖面積を測定するためのカスタム機械学習ベースのImageJワークフローを用いて定量化された。構造的アーキテクチャは、細胞壁（コンカナバリンA）、細胞内タンパク質（SYPRO Ruby）、および核（DAPI）で染色されたホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片を用いた共焦点顕微鏡により分析された。
• トランスクリプトミクス： RNAシーケンシング（RNAseq）が、液中懸濁バイオフィルム、表面付着型バイオフィルム、および浮遊細胞（プランクトニック）コントロールに対して、初期（5時間）および成熟期（24時間）のタイムポイントで行われた。発現変動解析はlimma-voom法を用いて行われ、遺伝子オントロジー（GO）濃縮解析はCandida Genome Databaseを介して実施された。
• 遺伝学的解析： 6つの主要なバイオフィルム転写因子（Bcr1, Brg1, Efg1, Ndt80, Rob1, Tec1）を欠損させた変異体を用い、液中懸濁バイオフィルム形成能をテストすることで、制御の依存性を決定した。
• 薬物耐性および分散： フルコナゾールおよびカスポファンギンに対する定着型最小発育阻止濃度（SMIC50）アッセイを実施した。分散能については、成熟した液中懸還バイオフィルムを新しいプラスチック表面に転移させ、新たな表面付着増殖の播種を観察することでテストした。

主な結果

• 液中懸濁バイオフィルムの形成： C. albicansは、付着しにくい表面（アガロース）に直面した場合、あるいは表面付着型バイオフィルムが利用可能な付着スペースを使い果たした場合に、自発的に高密度で構造的に複雑な液中懸濁バイオフィルムを形成する。これらの構造は、単純な浮遊細胞の凝集体とは異なり、多様な細胞形態（酵母型、偽菌糸、および真菌糸）が広範な菌糸ネットワークによって相互に連結された、高密度のクラスターで構成されている。
• トランスクリプトの収束： 液中懸濁バイオフィルムは、表面付着型バイオフィルムと有意な転写プログラムを共有している。5時間時点では、両形態間でアップレギュレートされた遺伝子の59%が重複しており、これは24時間時点では69%に増加した。両形態ともに、細胞増殖、ストレス応答、および付着に関与する遺伝子をアップレギュレートしている。
• 制御メカニズム： 液中懸濁バイオフィルムの形成は、表面付着型バイオフィルムと同じマスター転写調節因子によって制御されている。rob1Δ/Δおよびefg1Δ/Δ変異体は液中懸濁バイオフィルムを形成できず、ndt80Δ/Δ、brg1Δ/Δ、およびtec1Δ/Δは形態の異常またはバイオマスの減少を示した。bcr1Δ/Δ変異体は、表面付着モデルにおける挙動と同様に、正常な懸濁バイオフィルムを形成した。
• 薬物耐性： 液中懸濁バイオフィルムは、フルコナゾールに対して高い耐性（SMIC50 > 25 µg/mL）を示し、これは表面付着型バイオフィルムと同等であり、浮遊細胞よりも著しく高い。一方で、カスポファンギンに対しては、浮遊細胞コントロールと同様に感受性を維持している。
• 分散メカニズム： 成熟した表面付着型バイオフィルムは、48時間後に液中懸濁バイオフィルムへと移行する。これらの懸濁バイオフィルムは、新しいプラスチック表面に転移させることで、新たな表面付着増殖を播種することができ、分散における機能的な役割を示した。
• 鉄応答： 成熟した液中懸濁バイオフィルムは、表面付着型バイオフィルムと比較して、鉄獲得およびヘム酸化に関連する遺伝子（例：CSA1, CSA2, HMX1）のより顕著なアップレギュレーションを示しており、これは懸濁環境における鉄制限への強化された応答を示唆している。

意義および主張
本研究は、C. albicansの液中懸濁バイオフィルムを、表面付着型バイオフィルムと機能的に結びついた、独立した「真の（bona fide）」バイオフィルム形態として確立するものである。著者らは、この形態が単なる凝集体の集まりではなく、同一の転写ネットワークと薬物耐性特性を共有する、制御されたコミュニティであると主張している。

本論文は、液中懸濁バイオフィルムが、抗真菌薬および免疫耐性を伴う分散の潜在的なメカニズムとして機能すると仮定している。表面への付着スペースが制限された際に、表面付着型から液中懸濁型へと移行することで、C. albicansはこれらの構造を利用してホスト内の新しい部位へと拡散している可能性がある。この知見は、標準的な表面付着モデルを超えてバイオフィルムの発達に関する現在の理解を拡張するものであり、表面への付着が制限される状況や、成熟したバイオフィルムが分散しなければならない状況において、懸濁バイオフィルムが、これまで過小評価されていたC. albicansの病原性における重要な因子となり得ることを示唆している。