SERPINE1 as a critical CAF-associated gene promotes myCAF phenotype activation and exosome-mediated gastric cancer progression

기술 요약: 위암의 myCAF 표현형 활성화 및 엑소좀 매개 진행을 촉진하는 핵심 CAF 관련 유전자로서의 SERPINE1

문제 제기
위암(GC), 특히 위선암(STAD)은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있다. 종양 미세환경(TME)이 종양 진행의 결정적인 동력이라는 점은 잘 알려져 있으나, 암 관련 섬유아세포(CAF)가 위암을 조절하는 구체적인 분자 기전은 아직 완전히 이해되지 않았다. 특히 근섬유아세포 아형(myCAF)은 종양 성장, 전이 및 면역 억제를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 그러나 CAF 내에서 이들의 활성화와 그에 따른 엑소좀을 통한 종양 세포와의 의사소통을 용이하게 하는 구체적인 유전적 드라이버는 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 특히, 종양 세포에서의 역할과는 별개로 CAF 내에서의 SERPINE1(PAI-1 인코딩)의 역할에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다.

연구 방법론
본 연구는 생물정보학, in vitro 세포 분석, 단백질체학 및 in vivo 동물 모델을 통합한 다단계 접근 방식을 채택하였다:

1. 생물정보학적 스크리닝: The Cancer Genome Atlas(TCGA)의 STAD 종양 샘플 368개와 정상 샘플 36개를 대상으로 RNA-seq 데이터를 분석하였다. 차별 발현 유전자(DEG)를 식별한 후, 가중 유전자 공발현 네트워크 분석(WGCNA)을 통해 유전자 모듈과 CAF 침윤 점수(EPIC, MCP-counter, xCell 알고리즘을 통해 계산됨) 간의 상관관계를 분석하였다.
2. 유전자 선택: 주요 CAF 관련 유전자를 선별하기 위해 단변량 Cox 회귀 분석, LASSO 회귀 분석, 랜덤 생존 포레스트(Random Survival Forest) 분석 및 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축을 수행하여 예후가 좋은 허브 유전자를 식별하였다.
3. 세포 검증: 일차 배양된 위암 유래 CAF(GC-CAF)와 정상 섬유아세포(NF)를 배양하였다. siRNA 녹다운(knockdown) 및 렌티바이러스 과발현을 통해 SERPINE1 발현을 조절하였다.
   • 표현형 분석: CCK-8, 콜로니 형성, 상처 치유(wound healing), Transwell 침습 및 세포 사멸 분석을 수행하여 CAF의 증식, 이동 및 침습 능력을 평가하였다.
   • 활성화 분석: TGF-β1을 처리하여 NF를 myCAF로 분화시켰다. SERPINE1 조절이 myCAF 마커(α-SMA, FAP, COL1A1)에 미치는 영향을 RT-qPCR, 웨스턴 블로팅 및 면역 형광 염색을 통해 평가하였다.
   • 경로 분석: PI3K-Akt 신호 전달 경로를 조사하였으며, 이를 위해 인산화된 단백질에 대한 웨스턴 블로팅 및 약리학적 억제(PI3K/AKT-IN-1)를 사용하였다.
4. 엑소좀 특성 분석: 초원심분리법을 통해 CAF 배양 상층액으로부터 엑소좀을 분리하였다. 투과 전자 현미경(TEM)과 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 형태와 크기를 확인하였다. 비표적 단백질체학(질량 분석법)을 사용하여 화물(cargo) 단백질을 식별하였다.
5. 기능적 엑소좀 분석: 위암 세포(AGS 및 NCI-N87)를 CAF 유래 엑소좀으로 처리하였다. 구형 형성(sphere formation) 분석을 통해 줄기세상(stemness)을 평가하였으며, 웨스턴 블로팅과 RT-qPCR을 사용하여 줄기세상 마커(CD44, CD133, SOX2, OCT4)를 측정하였다.
6. In Vivo 모델: BALB/c 맹납(nude) 마우스를 사용하여 피하 이식형 제노그래프트 및 비장 주입 간 전이 모델을 구축하였다. SERPINE1이 조절된 CAF로부터 유래된 엑소좀을 꼬리 정맥 주사하였다. 종양 성장, 전이 및 골수 유래 억제 세포(MDSC) 침윤을 유세포 분석 및 H&E 염색을 통해 평가하였다.

주요 기여 및 결과

• SERPINE1의 식별: 생물정보학적 분석을 통해 SERPINE1이 STAD에서 CAF 풍부도와 높은 상관관계를 갖는 최상위 예후 허브 유전자임을 확인하였다. 높은 SERPINE1 발현은 불량한 전체 생존율과 연관되어 있었다. 단일 세포 RNA 시퀀싱은 섬유아세포가 위암(GC) TME 내에서 SERPINE1의 주요 공급원임을 확인해주었다.
• CAF 활성화에서의 역할: SERPINE1은 NF에 비해 GC-CAF에서 높게 발현되는 것으로 나타났다. In vitro 실험 결과, SERPINE1은 CAF의 증식과 이동을 촉진하지만 세포 사멸에는 유의미한 영향을 미치지 않았다. 결정적으로, SERPINE1은 TGF-β에 의해 유도되는 NF-to-myCAF 전환을 증폭시키는 핵심적인 역할을 한다. SERPINE1 과발현은 myCAF 마커(α-SMA, FAP, COL1A1)의 발현을 강화한 반면, 녹다운은 이를 억제하였다.
• 작용 기전 (PI3K-Akt): 본 연구는 SERPINE1이 PI3K-Akt 신호 전달 경로를 통해 myCAF 활성화를 촉진한다는 것을 입증하였다. SERPINE1 녹다운은 PI3K 및 Akt의 인산화를 감소시킨 반면, 과발현은 이를 증가시켰다. PI3K-Akt의 약리학적 억제는 SERPINE1 과발현의 촉진 효과를 역전시켰다.
• 엑소좀 매개 종양 진행: CAF 유래 엑소좀은 SERPINE1이 농축되어 있음이 밝혀졌다. 이 엑소좀들은 SERPINE1을 위암 세포로 전달하여 종양 세포의 증식, 이동 및 침습을 유의미하게 강화하였다.
• 줄기세상 조절: 엑소좀 SERPINE1은 위암 세포의 줄기세상을 조절하였다. AGS(HER2 음성) 세포에서 SERPINE1이 결핍된 엑소좀은 줄기세상 마커 발현과 구형 형성을 감소시킨 반면, 과발현된 엑소좀은 이를 증가시켰다. NCI-N87(HER2 양성) 세포에서는 녹다운 시 효과가 덜 뚜렷했으나 과발현 시에는 여전히 유의미했는데, 이는 구성적 HER2 신호 전달에 의해 영향을 받는 세포주 의존적 메커니즘을 시사한다.
• MDSC를 통한 면역 억제: In vivo 모델 결과, SERPINE1이 풍부한 CAF 유래 엑소좀은 위암 성장을 촉진하고 간 전이를 유도하였다. 또한, 이 엑소좀들은 종양 미세환경 내 CD11b+ MDSC의 침윤을 유의미하게 증가시켜 면역 억제 상태를 강화하였다. 본 연구는 SERPINE1이 MDSC의 하위 집단(M-MDSC 대 PMN-MDSC) 비율보다는 전체 양에 주로 영향을 미친다는 점을 언급하였다.

의의 및 주장
저자들은 SERPINE1이 위암에서 CAF 생물학의 핵심 조절자라고 결론짓는다. 이 연구의 의의는 다음 세 가지 측면에서 중요하다:

1. myCAF 활성화: SERPINE1은 PI3K-Akt 경로를 통해 정상 섬유아세포가 종양 촉진성 myCAF로 전환되는 TGF-β 유도 과정을 증폭시키는 핵심 요소로 작용한다.
2. 세포 간 의사소통: 이는 CAF 유래 엑소좀의 화물(cargo)로서 기능하며, 위암 세포의 줄기세상 및 전이 잠재력을 직접적으로 강화한다.
3. 치료 표적: 종양 진행을 촉진하고 MDSC 모집을 통해 면역 억제 미세환경을 형성함으로써, SERPINE1은 유망한 치료 표적이 된다. 저자들은 SERPINE1을 표적으로 삼는 것이 myCAF 활성화를 억제하고 종양 성장을 막아 위암의 예후를 개선할 수 있는 잠재적 전략이 될 수 있다고 제안한다.

본 연구는 조직 스트레스 및 염증과의 상호작용에 대한 추가 탐구가 필요하며, CAF 자체 내에서의 SERPINE1의 직접적인 기능적 역할(엑소좀 효과와 구별되는)에 대한 in vivo 검증이 부족하다는 한계점을 인정하였다. 그러나 현재의 결과는 SERPINE1, CAF, 엑소좀, 그리고 위암 진행을 연결하는 기전적 틀을 제공한다.