SERPINE1 as a critical CAF-associated gene promotes myCAF phenotype activation and exosome-mediated gastric cancer progression

技術要約：胃癌の進行におけるmyCAF表現型の活性化およびエクソソームを介した進行を促進する重要なCAF関連遺伝子としてのSERPINE1

問題提起
胃癌（GC）、特に胃腺癌（STAD）は、依然として世界的に癌関連死亡の主要な原因となっている。腫瘍微小環境（TME）が腫瘍の進行を駆動する重要な要因であることは認識されているが、癌関連線維芽細胞（CAF）が胃癌をどのように制御しているかという具体的な分子メカニズムについては、完全には解明されていない。特に、筋線維芽細胞サブタイプ（myCAF）は、腫瘍の増殖、転移、および免疫抑制を促進することが知られている。しかし、CAFs内における特定の遺伝的ドライバーが、いかにしてそれらの活性化を促進し、その後のエクソソームを介した腫瘍細胞とのコミュニケーションを促進しているのかについては、十分に解明されていない。具体的には、腫瘍細胞における役割とは異なる、CAFs内におけるSERPINE1（PAI-1をコードする）の役割について、さらなる調査が必要である。

方法論
本研究では、バイオインフォマティクス、in vitro細胞アッセイ、プロテオミクス、およびin vivo動物モデルを統合した多段階のアプローチを用いた：

1. バイオインフォマティクスによるスクリーニング： The Cancer Genome Atlas（TCGA）の368のSTAD腫瘍サンプルと36の正常サンプルから得られたRNA-seqデータを解析した。差異発現遺伝子（DEG）を特定した後、加重遺伝子共発現ネットワーク解析（WGCNA）を用いて、遺伝子モジュールとCAF浸潤スコア（EPIC、MCP-counter、xCellアルゴリズムにより算出）との相関を分析した。
2. 遺伝子の選択： 主要なCAF関連遺伝子を、単変量Cox回帰、LASSO回帰、Random Survival Forest分析、およびタンパク質相互作用（PPI）ネットワーク構築を用いてスクリーニングし、予後に関連するハブ遺伝子を特定した。
3. 細胞学的検証： 初代培養された胃癌由来CAF（GC-CAF）および正常線維芽細胞（NF）を培養した。SERPINE1の発現は、siRNAによるノックダウンおよびレンチウイルスによる過剰発現によって制御した。
   • 表現型アッセイ： CCK-8、コロニー形成、創傷治癒、Transwell浸潤、およびアポトーシスアッセイを実施し、CAFの増殖、移動、および浸潤を評価した。
   • 活性化アッセイ： TGF-β1で処理してmyCAFへの分化を誘導したNFを用いた。myCAFマーカー（α-SMA、FAP、COL1A1）に対するSERPINE1変調の影響を、RT-qPCR、ウェスタンブロッティング、および免疫蛍光染色により評価した。
   • 経路解析： PI3K-Aktシグナル伝達経路を、リン酸化タンパク質のウェスタンブロッティングおよび薬理学的阻害（PI3K/AKT-IN-1）を用いて調査した。
4. エクソソームの特性解析： 超遠心分離法によりCAFの培養上清からエクソソームを単離した。形態およびサイズは、透過型電子顕微鏡（TEM）およびナノ粒子トラッキング解析（NTA）によって確認した。非標的プロテオミクス（質量分析）を用いて、カーゴタンパク質を同定した。
5. 機能的エクソソウムアッセイ： 胃癌細胞（AGSおよびNCI-N87）をCAF由来のエクソソームで処理した。スフィア形成アッセイにより、幹細胞性を評価した。また、ウェスタンブロッティングおよびRT-qPCRを用いて、幹細胞性マーカー（CD44、CD133、SOX2、OCT4）を測定した。
6. In Vivo モデル： BALB/c ヌードマウスを用いて、皮下移植異種移植モデルおよび脾臓注入肝転移モデルを確立した。SERPINE1が変調されたCAF由来のエクソソームを尾静脈注射した。マウスの腫瘍増殖、転移、および骨髄由来抑制細胞（MDSC）の浸潤を、フローサイトメトリーおよびH&E染色を用いて評価した。

主な貢献および結果

• SERPINE1の特定： バイオインフォマティクス解析により、SERPINE1がSTADにおいてCAFの存在量と高い相関を示す、最有力な予後ハブ遺伝子であることが特定された。SERPINE1の高発現は、全生存期間の悪化と関連していた。シングルセルRNAシーケンシングにより、胃癌のTMEにおいて線維芽細胞がSERPINE1の主要な供給源であることが確認された。
• CAF活性化における役割： SERPINE1は、NFと比較してGC-CAFにおいて高発現していることが判明した。in vitro実験により、SERPINE1はCAFの増殖と移動を促進するが、アポトーシスには有意な影響を与えないことが示された。決定的なことに、SERPINE1はTGF-βによるNFからmyCAFへの転換を増幅させる重要な因子として機能する。SERPINE1の過剰発現はmyCAFマーカー（α-SMA、FAP、COL1A1）の発現を増強したが、ノックダウンはこれを抑制した。
• 作用機序（PI3K-Akt）： 本研究は、SERPINE1がPI3K-Aktシグナル伝達経路を介してmyCAFの活性化を促進することを確立した。SERPINE1のノックダウンはPI3KおよびAktのリン酸化を減少させ、過剰発現はこれを増加させた。PI3K-Aktの薬理学的阻害は、SERPINE1過剰発現による促進的活性化効果を逆転させた。
• エクソソームを介した腫瘍進行： CAF由来のエクソソームはSERPINE1を豊富に含んでいることが判明した。これらのエクソソームはSERPINE1を胃癌細胞へと転移させ、腫瘍細胞の増殖、移動、および浸潤を有意に増強した。
• 幹細胞性の調節： エクソソーム内のSERPINE1は、胃癌細胞の幹細胞性を制御していた。AGS（HER2陰性）細胞において、SERPINE1をサイレンシングしたエクソソームは幹細胞性マーカーの発現とスフィア形成を減少させたが、過剰発現させたエクソソームはこれらを増加させた。NCI-N87（HER2陽性）細胞においては、ノックダウンによる影響は限定的であったが、過剰発現による影響は依然として有意であり、これは構成的なHER2シグナルに影響される可能性のある細胞株依存的なメカニズムを示唆している。
• MDSCを介した免疫抑制： in vivoモデルにおいて、SERPINE1を豊富に含むCAF由来のエクソソームは、胃癌の腫瘍増殖および肝転移を促進した。さらに、これらのエクソソームは腫瘍微小環境におけるCD11b+ MDSCの浸潤を有意に増加させ、免疫抑制状態を強化した。本研究では、SERPINE1はMDSCのサブセットの比率（M-MDSC対PMN-MDSC）よりも、主にMDSCの総量に影響を与えることが指摘された。

意義および主張
著者らは、SERPINE1が胃癌におけるCAFの生物学を制御する重要な調節因子であると結論付けている。その意義は主に以下の3点にある：

1. myCAFの活性化： SERPINE1は、TGF-βによって駆動される正常線維芽細胞から前腫瘍性のmyCAFへの転換を増幅させる鍵となる因子として機能する。
2. 細胞間コミュニケーション： SERPINE1は、CAF由来のエクソソーム内のカーゴとして機能し、胃癌細胞の増殖、幹細胞性、および転移能を直接的に高める。
3. 治療標的： MDSCの動員を通じて腫瘍進行を促進し、免疫抑制的な微小環境を形成するSERPINE1は、有望な治療標的である。著者らは、SERPINE1を標的とすることでmyCAFの活性化と腫瘍増殖を抑制でき、胃癌の予後を改善するための潜在的な戦略を提供できると提案している。

本研究は、制限事項として、特に（エクソソームの効果とは別に）CAF自体におけるSERPINE1の直接的な機能的役割に関するin vivoでの検証が不足していること、および組織のストレスや炎症との相互作用に関するさらなる探索の必要性を認めている。しかしながら、現在の知見は、SERPINE1、CAF、エクソソーム、および胃癌の進行を結びつけるメカニズムの枠組みを提供している。