SERPINE1 as a critical CAF-associated gene promotes myCAF phenotype activation and exosome-mediated gastric cancer progression

Resumo Técnico: SERPINE1 como um Gene Crítico Associado a CAFs que Promove a Ativação do Fenótipo myCAF e a Progressão do Câncer Gástrico Mediada por Exossomos

Definição do Problema
O câncer gástrico (CG), particularmente o adenocarcinoma estomacal (STAD), continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer globalmente. Embora o microambiente tumoral (MET) seja reconhecido como um impulsionador crítico da progressão tumoral, os mecanismos moleculares específicos pelos quais os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) regulam o CG ainda não são totalmente compreendidos. Os CAFs, especialmente o subtipo miofibroblástico (myCAFs), são conhecidos por promover o crescimento tumoral, metástase e imunossupressão. No entanto, os drivers genéticos específicos dentro dos CAFs que facilitam sua ativação e subsequente comunicação com células tumorais via exossomos ainda não foram totalmente elucidados. Especificamente, o papel do SERPINE1 (que codifica a PAI-1) dentro dos CAFs, distinto de seu papel nas células tumorais, requer investigação adicional.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem de múltiplas etapas integrando bioinformática, ensaios celulares in vitro, proteômica e modelos animais in vivo:

1. Triagem Bioinformática: Dados de RNA-seq de 368 amostras de tumor STAD e 36 amostras normais do The Cancer Genome Atlas (TCGA) foram analisados. Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados, seguidos de Análise de Rede de Coexpressão Ponderada (WGCNA) para correlacionar módulos gênicos com escores de infiltração de CAF (calculados via algoritmos EPIC, MCP-counter e xCell).
2. Seleção de Genes: Genes chave relacionados a CAF foram triados usando regressão de Cox univariada, regressão LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator), análise de Floresta Aleatória de Sobrevivência e construção de rede de Interação Proteína-Proteína (PPI) para identificar genes hub prognósticos.
3. Validação Celular: CAFs primários de GC e fibroblastos normais (NFs) foram cultivados. A expressão de SERPINE1 foi modulada via silenciamento por siRNA e superexpressão por lentivírus.
   • Ensaios Fenotípicos: Ensaios de CCK-8, formação de colônias, cicatrização (wound healing), invasão em Transwell e apoptose foram realizados para avaliar proliferação, migração e invasão de CAFs.
   • Ensaios de Ativação: NFs foram tratados com TGF-β1 para induzir a diferenciação de myCAF. Os efeitos da modulação de SERPINE1 nos marcadores de myCAF (α-SMA, FAP, COL1A1) foram avaliados via RT-qPCR, Western blotting e imunofluorescência.
   • Análise de Via: A via de sinalização PI3K-Akt foi investigada usando Western blotting para proteínas fosforiladas e inibição farmacológica (PI3K/AKT-IN-1).
4. Caracterização de Exossomos: Exossomos foram isolados de sobrenadantes de CAFs via ultracentrifugação. A morfologia e o tamanho foram confirmados por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) e Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA). A proteômica não direcionada (espectrometria de massa) foi usada para identificar o conteúdo proteico.
5. Ensaios Funcionais de Exossomos: Células de GC (AGS e NCI-N87) foram tratadas com exossomos derivados de CAFs. Ensaios de formação de esferas avaliaram a capacidade de stemness, enquanto Western blotting e RT-qPCR mediram marcadores de stemness (CD44, CD133, SOX2, OCT4).
6. Modelos In Vivo: Modelos de xenotransplante subcutâneo e de metástase hepática por injeção esplênica foram estabelecidos em camundongos nude BALB/c. Os camundongos receberam injeções na veia caudal de exossomos derivados de CAFs modulados para SERPINE1. O crescimento tumoral, metástase e infiltração de Células Supressoras de Origem Mieloide (MDSCs) foram avaliados via citometria de fluxo e coloração H&E.

Principais Contribuições e Resultados

• Identificação de SERPINE1: A análise bioinformática identificou o SERPINE1 como um gene hub prognóstico superior altamente correlacionado com a abundância de CAF em STAD. A alta expressão de SERPINE1 foi associada a uma baixa sobrevida global. O sequenciamento de RNA de célula única confirmou que os fibroblastos são a principal fonte de SERPINE1 no MET de GC.
• Papel na Ativação de CAF: Descobriu-se que o SERPINE1 é altamente expresso em GC-CAFs em comparação com NFs. Experimentos in vitro demonstraram que o SERPINE1 promove a proliferação e migração de CAFs, mas não afeta significativamente a apoptose. Crucialmente, o SERPINE1 atua como um amplificador crítico da transição de NF para myCAF induzida por TGF-β. A superexpressão de SERPINE1 aumentou a expressão de marcadores de myCAF (α-SMA, FAP, COL1A1), enquanto o silenciamento a suprimiu.
• Mecanismo de Ação (PI3K-Akt): O estudo estabeleceu que o SERPINE1 promove a ativação de myCAF através da via de sinalização PI3K-Akt. O silenciamento de SERPINE1 reduziu a fosforilação de PI3K e Akt, enquanto a superexpressão a aumentou. A inibição farmacológica de PI3K-Akt reverteu os efeitos pró-ativação do SERPINE1.
• Progressão Tumoral Mediada por Exossomos: Descobriu-se que exossomos derivados de CAF são enriquecidos com SERPINE1. Esses exossomos transferiram SERPINE1 para células de câncer gástrico, aumentando significativamente a proliferação, migração e invasão das células tumorais.
• Regulação da Stemness: O SERPINE1 exossomal regulou a stemness das células de câncer gástrico. Em células AGS (HER2-negativas), exossomos com silenciamento de SERPINE1 reduziram a expressão de marcadores de stemness e a formação de esferas, enquanto exossomos com superexpressão as aumentaram. Em células NCI-N87 (HER2-positivas), o efeito foi menos pronunciado após o silenciamento, mas ainda significativo após a superexpressão, sugerindo um mecanismo dependente de linhagem celular potencialmente influenciado pela sinalização constitutiva de HER2.
• Imunossupressão via MDSCs: Modelos in vivo revelaram que exossomos derivados de CAF enriquecidos com SERPINE1 promoveram o crescimento de tumores gástricos e metástase hepática. Além disso, esses exossomos aumentaram significativamente a infiltração de MDSCs CD11b+ no microambiente tumoral, reforçando um estado imunossupressor. O estudo observou que o SERPINE1 afetou primariamente a quantidade total de MDSCs, em vez da razão de seus subtipos (M-MDSCs vs. PMN-MDSCs).

Significância e Alegações
Os autores concluem que o SERPINE1 é um regulador crítico da biologia de CAF no câncer gástrico. Sua significância reside em três áreas principais:

1. Ativação de myCAF: Funciona como um amplificador chave da transição de fibroblastos normais para myCAFs pró-tumorais via via PI3K-Akt.
2. Comunicação Intercelular: Serve como uma carga em exossomos derivados de CAF que aumenta diretamente a malignidade das células de câncer gástrico, incluindo stemness e potencial metastático.
3. Alvo Terapêutico: Ao promover a progressão tumoral e moldar um microambiente imunossupressor através do recrutamento de MDSCs, o SERPINE1 representa um alvo terapêutico promissor. Os autores propõem que o direcionamento do SERPINE1 poderia suprimir a ativação de myCAF e o crescimento tumoral, oferecendo uma estratégia potencial para melhorar os desfechos do GC.

O estudo reconhece limitações, especificamente a falta de validação in vivo quanto ao papel funcional direto do SERPINE1 dentro dos próprios CAFs (distinto dos efeitos exossomais) e a necessidade de maior exploração das interações com estresse tecidual e inflamação. No entanto, os achados atuais fornecem um arcabouço mecanístico ligando SERPINE1, CAFs, exossomos e a progressão do GC.