SERPINE1 as a critical CAF-associated gene promotes myCAF phenotype activation and exosome-mediated gastric cancer progression

Resumen Técnico: SERPINE1 como un gen crítico asociado a los CAF que promueve la activación del fenotipo myCAF y la progresión del cáncer gástrico mediada por exosomas

Planteamiento del problema
El cáncer gástrico (CG), particularmente el adenocarcinoma estomacal (STAD), sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial. Aunque el microambiente tumoral (MAT) es reconocido como un impulsor crítico de la progresión tumoral, los mecanismos moleculares específicos mediante los cuales los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) regulan el CG aún no se comprenden completamente. Los CAF, especialmente el subtipo miofibroblástico (myCAF), son conocidos por promover el crecimiento tumoral, la metástasis y la inmunosupresión. Sin embargo, los impulsores genéticos específicos dentro de los CAF que facilitan su activación y la subsiguiente comunicación con las células tumorales a través de exosomas no han sido plenamente elucidados. Específicamente, el papel de SERPINE1 (que codifica PAI-1) dentro de los CAF, a diferencia de su papel en las células tumorales, requiere mayor investigación.

Metodología
El estudio empleó un enfoque de múltiples pasos integrando bioinformática, ensayos celulares in vitro, proteómica y modelos animales in vivo:

1. Tamizaje bioinformático: Se analizaron datos de RNA-seq de 368 muestras de tumores STAD y 36 muestras normales de The Cancer Genome Atlas (TCGA). Se identificaron genes diferencialmente expresados (DEG), seguido de un Análisis de Red de Coexpresión de Genes Ponderados (WGCNA) para correlacionar los módulos de genes con las puntuaciones de infiltración de CAF (calculadas mediante los algoritmos EPIC, MCP-counter y xCell).
2. Selección de genes: Se cribaron genes clave relacionados con los CAF utilizando regresión de Cox univariante, regresión de LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator), análisis de Bosque de Supervivencia Aleatoria (Random Survival Forest) y construcción de redes de Interacción Proteína-Proteína (PPI) para identificar genes centrales pronósticos.
3. Validación celular: Se cultivaron CAF primarios de GC y fibroblastos normales (NF). La expresión de SERPINE1 se moduló mediante el silenciamiento por siRNA y la sobreexpresión por lentivirus.
   • Ensayos fenotípicos: Se realizaron ensayos de CCK-8, formación de colonias, curación de heridas, invasión en Transwell y ensayos de apoptosis para evaluar la proliferación, migración e invasión de los CAF.
   • Ensayos de activación: Los NF fueron tratados con TGF-β1 para inducir la diferenciación a myCAF. Se evaluaron los efectos de la modulación de SERPINE1 en los marcadores de myCAF (α-SMA, FAP, COL1A1) mediante RT-qPCR, Western blotting e inmunofluorescencia.
   • Análisis de vías: Se investigó la vía de señalización PI3K-Akt mediante Western blotting para proteínas fosforiladas e inhibición farmacológica (PI3K/AKT-IN-1).
4. Caracterización de exosomas: Los exosomas se aislaron de los sobrenadantes de los CAF mediante ultracentrifugación. La morfología y el tamaño se confirmaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Se utilizó proteómica no dirigida (espectrometría de masas) para identificar las proteínas de la carga.
5. Ensayos funcionales de exosomas: Las células de GC (AGS y NCI-N87) fueron tratadas con exosomas derivados de CAF. Los ensayos de formación de esferas evaluaron la capacidad de autorrenovación (stemness), mientras que el Western blotting y la RT-qPCR midieron los marcadores de stemness (CD44, CD133, SOX2, OCT4).
6. Modelos in vivo: Se establecieron modelos de xenoinjerto subcutáneo e inyección esplénica de metástasis hepática en ratones BALB/c nude. Los ratones recibieron inyecciones en la vena de la cola de exosomas derivados de CAFs con SERPINE1 modulado. Se evaluó el crecimiento tumoral, la metástasis y la infiltración de células supresoras de origen mieloide (MDSC) mediante citometría de flujo y tinción de H&E.

Contribuciones clave y resultados

• Identificación de SERPINE1: El análisis bioinformático identificó a SERPINE1 como un gen central pronóstico clave altamente correlacionado con la abundancia de CAF en STAD. La alta expresión de SERPINE1 se asoció con una baja supervivencia global. La secuenciación de ARN de célula única confirmó que los fibroblastos son la fuente primaria de SERPINE1 en el MAT del GC.
• Papel en la activación de los CAF: Se encontró que SERPINE1 tiene una alta expresión en los GC-CAF en comparación con los NF. Los experimentos in vitro demostraron que SERPINE1 promueve la proliferación y migración de los CAF, pero no afecta significativamente la apoptosis. Crucialmente, SERPINE1 actúa como un amplificador crítico de la transición de NF a myCAF inducida por TGF-β. La sobreexpresión de SERPINE1 aumentó la expresión de marcadores de myCAF (α-SMA, FAP, COL1A1), mientras que el silenciamiento la suprimió.
• Mecanismo de acción (PI3K-Akt): El estudio estableció que SERPINE1 promueve la activación de los myCAF a través de la vía de señalización PI3K-Akt. El silenciamiento de SERPINE1 redujo la fosforilación de PI3K y Akt, mientras que la sobreexpresión la aumentó. La inhibición farmacológica de PI3K-Akt revirtió los efectos pro-activación de la sobreexpresión de SERPINE1.
• Progresión tumoral mediada por exosomas: Se encontró que los exosomas derivados de CAF están enriquecidos con SERPINE1. Estos exosomas transfirieron SERPINE1 a las células de cáncer gástrico, mejorando significativamente la proliferación, migración e invasión de las células tumorales.
• Regulación de la capacidad de autorrenovación (stemness): El SERPINE1 exosomal reguló la capacidad de autorrenovación de las células de cáncer gástrico. En células AGS (HER2-negativas), los exosomas con silenciamiento de SERPINE1 redujeron la expresión de marcadores de stemness y la formación de esferas, mientras que los exosomas con sobreexpresión los aumentaron. En células NCI-N87 (HER2-positivas), el efecto fue menos pronunciado tras el silenciamiento, pero seguía siendo significativo tras la sobreexpresión, lo que sugiere un mecanismo dependiente de la línea celular potencialmente influenciado por la señalización constitutiva de HER2.
• Inmunosupresión vía MDSCs: Los modelos in vivo revelaron que los exosomas derivados de CAF enriquecidos con SERPINE1 promovieron el crecimiento del tumor gástrico y la metástasis hepática. Además, estos exosomas aumentaron significativamente la infiltración de MDSC CD11b+ en el microambiente tumoral, reforzando un estado inmunosupresor. El estudio observó que SERPINE1 afectó principalmente la cantidad total de MDSC en lugar de la proporción de sus subgrupos (M-MDSCs frente a PMN-MDSCs).

Significancia y afirmaciones
Los autores concluyen que SERPINE1 es un regulador crítico de la biología de los CAF en el cáncer gástrico. Su importancia radica en tres áreas principales:

1. Activación de myCAF: Funciona como un amplificador clave de la transición de fibroblastos normales a myCAFs pro-tumorales impulsada por TGF-β a través de la vía PI3K-Akt.
2. Comunicación intercelular: Sirve como una carga en los exosomas derivados de los CAF que mejora directamente la malignidad de las células de cáncer gástrico, incluyendo la capacidad de autorrenovación y el potencial metastásico.
3. Objetivo terapéutico: Al promover la progresión tumoral y moldear un microambiente inmunosupresor mediante el reclutamiento de MDSC, SERPINE1 representa un objetivo terapéutico prometedor. Los autores proponen que el abordaje de SERPINE1 podría suprimir la activación de los myCAF y el crecimiento tumoral, ofreciendo una estrategia potencial para mejorar los resultados en el cáncer gástrico.

El estudio reconoce limitaciones, específicamente la falta de validación in vivo respecto al papel funcional directo de SERPINE1 dentro de los propios CAF (distinto de los efectos exosomales) y la necesidad de una mayor exploración de las interacciones con el estrés tisular y la inflamación. Sin embargo, los hallazgos actuales proporcionan un marco mecánico que vincula a SERPINE1, los CAF, los exosomas y la progresión del GC.