In vivo transcriptome analysis of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana strain GHA during infection against the beneficial predator tobacco leaf bug, Nesidiocoris tenuis (Hemiptera: Miridae)

기술 요약: Nesidiocoris tenuis 감염 중인 Beauveria bassiana GHA 균주의 In Vivo 전사체 분석

문제 제기
엔토모파토제닉(entomopathogenic) 곰팡이인 Beauveria bassiana GHA 균주는 해충 방제를 위해 널리 사용되는 상업용 마이코인섹티사이드(mycoinsecticide)이다. 그러나 이 균주의 주요 한계점은 유익한 포식성 곤충, 특히 농업에서 생물학적 해충 관리용으로 활용되는 담배잎벌레(Nesidiocoris tenuis, TLB)에 대해 높은 병원성을 보인다는 점이다. B. bassiana의 일반적인 감염 기전(큐티클 침투 후 혈림프 내 증식)은 이해되어 있으나, TLB에서 관찰되는 높은 치사율을 유발하는 구체적인 분자 병원성 메커니즘과 병원성 유전자는 아직 규명되지 않았다. 특정 병원성 인자를 식별하는 것은 비표적 효과(non-target effects)를 완화하면서도 해충에 대한 효능은 유지할 수 있는 전략을 개발하는 데 필수적이다.

연구 방법론
본 연구는 TLB를 감염시키는 B. bassiana GHA 균주의 감염 과정을 특징짓고 단계별 유전자 발현을 식별하기 위해 다단계 접근법을 채택하였다:

1. 감염 역학 및 현미경 관찰:

   • 접종: TLB에 두 가지 농도($5 \times 10^6$ 및 $5 \times 10^7$ conidia/mL)의 분생포자 현탁액을 접종하였다.
   • 형태학적 관찰: 주사 전자 현미경(SEM) 및 광학 현미경을 사용하여 접종 후 12, 18, 24, 36시간(hpi) 동안 분생포자 발아, 부착기(appressorium) 형성 및 균사 침투를 관찰하였다. 파라핀 매립 절편을 사용하여 24, 36, 48, 72, 96 hpi에 그로코트 메텐아민 실버(Grocott Methenamine Silver) 염색을 통해 내부 곰팡이 성장을 추적하였다.
   • 정량적 성장 모니터링: 숙주 DNA에서 추출한 host DNA를 대상으로 B. bassiana GHA 균주의 rDNA IGS 영역을 표적으로 하는 게놈 정량 PCR(qPCR)을 수행하여, 다양한 시점에서의 숙주 내 곰팡이 생물량(biomass) 축적을 정량화하였다.

2. 전사체 분석 (RNA-seq):

   • 샘플링: 역학 데이터를 기반으로 RNA 추출을 위한 두 가지 핵심 시점을 선정하였다: 36 hpi(큐티클 침로 단계 대표) 및 72 hpi(혈림프 증식 단계 대표).
   • 시퀀싱: 생존한 TLB를 풀링(pooling)하여 총 RNA를 추출하였으며, RNA-seq을 수행한 후 읽기(reads)를 B. bassiana ARSEF 2860 참조 게놈에 매핑하였다.
   • 차등 발현 분석: 두 단계 사이의 유전자 발현 수준을 비교하기 위해 TMM 정규화 및 통계 검정(edgeR)을 사용하여 차등 발현 유전자(DEGs)를 식별하였다.
   • 기능적 주석 달기: 식별된 DEGs의 기능적 역할을 규명하기 위해 유전자 풍부도 분석(Gene Ontology) 및 단백질 국소화 예측(Deep-Loc 2.1)을 수행하였다.

주요 결과

• 감염 진행:

  • 12 hpi에 분생포자 발아 및 부착기 형성이 확인되었다.
  • 36 hpi에 큐티클을 관통하는 침투성 균사가 처음으로 검출되었다.
  • 48 hpi에는 필라멘트 형태의 균사와 균사체가 큐티클 근처에서 관찰되었으며, 72 hpi에는 체강의 넓은 영역으로 확장되었다.
  • qPCR 데이터는 곰팡이 생물량의 점진적인 증가를 확인하였으며, 저농도 그룹에서 48 hpi 이후 급격한 상승이 나타났다. 이는 36 hpi와 72 hpi가 각각 침투 단계와 증식 단계를 분석하기에 적절한 시점임을 입증한다.

• 차등 유전자 발현:

  • 두 단계 사이에서 총 182개의 유전자가 유의미한 차등 발현을 보였다 (조정된 $p < 0.05$).
  • 36 hpi (침투 단계): 83개의 유전자가 상향 조절되었다 (DEGs36h). 이들은 세포 외 단백질 및 가수분해 효소에 풍부했다. 유전자 기능 분석(GO) 결과, "Glucosidases", "Signaling receptor binding", "Response to cytokine" 관련 용어가 강조되었다.
  • 72 hpi (증식 단계): 99개의 유전자가 상향 조절되었다 (DEGs72h). 이 유전자들은 유의미한 GO 용어 농축 없이 광범위한 기능 범주에 걸쳐 분포되어 있었으며, 이는 다양한 대사 경로에 분산되어 있음을 시사한다.

• 병원성 후보 유전자 식별:

  • 연구를 통해 기존에 보고된 16개의 병원성 유전자를 DEGs 중에서 식별하였다.
  • DEGs36h에는 큐티클 부착 관련 (Mad1), 부착기 형성 (Gas1), 면역 회피 (Bps8), 큐티클 분해 (ChiV4), 그리고 감염 과정 (Bbnmo5, BbNoxA, cfp) 관련 상동 유전자가 포함되었다.
  • DEGs72h에는 오오스포린(oosporein) 합성 관련 유전자 (OpS1, OpS2, OpS4–7), 형태적 전환을 조절하는 전사 인자 (BbHCR1), 페릴리핀 유사 유전자 (Mpl1), 그리고 퍼옥신 유전자 (BbPex1)가 포함되었다.
  • 특히, Mpl1은 Metarhizium robertsii에서 부착기 형성 시 지질 대사에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 본 연구에서는 이 상동 유전자가 72 hpi에서 높은 발현을 보여 B. bassiana에서의 잠재적인 대안적 기능을 시사하였다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 TLB에 대한 B. bassiana GHA 균주의 감염 과정을 기술하고, 특정 숙주 내에서 감염 단계에 따라 발현 패턴이 변하는 유전자를 식별한 첫 번째 연구라고 주장한다.

주요 의의는 비교 in vivo 전사체 분석이 병원성 유전자를 선택하는 데 효과적임을 입 demonstrating한 데 있다. 연구 결과는 큐티클 침투 단계에서 발현되는 유전자의 기능적 범주가 기존 모델인 모기(mosquito)의 감염 양상과 유사하지만, 개별 유전자 수준에서의 구체적인 유전자 발현 프로파일은 다르다는 것을 보여준다. 이는 병원성 메커니즘이 숙주 또는 균주 특이적일 수 있음을 나타낸다.

본 논문은 식별된 유전자들이 현재의 생물학적 방제 전략의 약점인 유익한 포식자(TLB 등)에 대한 B. bassiana의 병원성을 선택적으로 감소시키면서도 해충에 대한 효능은 유지할 수 있는 미래 연구의 잠재적 표적이 될 수 있다고 결론짓는다. 저자들은 이러한 후보 유전자들을 녹아웃(knock-out)하여 선택적 병원성 감소를 달성하고자 하는 향후 목표를 명시적으로 밝히고 있다.