In vivo transcriptome analysis of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana strain GHA during infection against the beneficial predator tobacco leaf bug, Nesidiocoris tenuis (Hemiptera: Miridae)

Resumen Técnico: Análisis del Transcriptoma In Vivo de Beauveria bassiana Cepa GHA Durante la Infección de Nesidiocoris tenuis

Planteamiento del Problema
El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana cepa GHA es un micoinsecticida comercial ampliamente utilizado para el control de plagas. Sin embargo, una limitación significativa de esta cepa es su alta virulencia hacia insectos depredadores beneficiosos, específicamente la chinche del tabaco (Nesidiocoris tenuis, TLB), que se utiliza en la agricultura para el manejo biológico de plagas. Aunque el mecanismo general de infección de B. bassiana (penetración de la cutícula seguida de proliferación en el hemocel) se comprende, los mecanismos moleculares de patogenicidad específicos y los genes de virulencia responsables de la alta mortalidad observada en los TLB permanecen sin caracterizar. La identificación de estos factores de virulencia específicos es esencial para desarrollar estrategias que mitiguen los efectos sobre organismos no objetivo en depredadores beneficiosos, manteniendo al mismo tiempo la eficacia contra las plagas.

Metodología
El estudio empleó un enfoque de múltiples etapas para caracterizar el proceso de infección e identificar la expresión génica específica de la etapa de B. bassiana cepa GHA infectando a TLBs:

1. Cinética de Infección y Microscopía:

   • Inoculación: Los TLBs fueron inoculados con suspensiones de conidios a dos concentraciones ($5 \times 10^6$ y $5 \times 10^7$ conidios/mL).
   • Observación Morfológica: Se utilizaron microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de luz para observar la germinación de los conidios, la formación de apresorios y la invasión de hifas a las 12, 18, 24 y 36 horas post-inoculación (hpi). Se examinaron secciones embebidas en parafina teñidas con Plata de Metenamina de Grocott para rastrear el crecimiento fúngico interno a las 24, 36, 48, 72 y 96 hpi.
   • Monitoreo Cuantitativo del Crecimiento: Se realizó qPCR genómica dirigida a la región IGS del rDNA de la cepa GHA en el ADN del huésped en varios puntos temporales para cuantificar la acumulación de biomasa fúngica dentro del huésped.

2. Análisis Transcriptómico (RNA-seq):

   • Muestreo: Basándose en los datos cinéticos, se seleccionaron dos puntos temporales críticos para la extracción de RNA: 36 hpi (que representa la etapa de penetración de la cutícula) y 72 hpi (que representa la etapa de proliferación en el hemocel).
   • Secuenciación: Se extrajo RNA total de TLBs supervivientes agrupados, y se realizó RNA-seq mapeando las lecturas al genoma de referencia ARSEF 2860 de B. bassiana.
   • Análisis de Expresión Diferencial: Se compararon los niveles de expresión génica entre las etapas de 36 hpi y 72 hpi utilizando normalización TMM y pruebas estadísticas (edgeR) para identificar genes diferencialmente expresados (DEGs).
   • Anotación Funcional: Se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (Gene Ontology) y predicciones de localización de proteínas (Deep-Loc 2.1) para caracterizar las funciones de los DEGs identificados.

Resultados Clave

• Progresión de la Infección:

  • La germinación de conidios y la formación de apresorios fueron confirmadas a las 12 hpi.
  • Se detectaron hifas invasoras penetrando la cutícula por primera vez a las 36 hpi.
  • A las 48 hpi, se observaron hifas filamentosas y cuerpos hifales cerca de la cutícula, expandiéndose a un área amplia de la cavidad corporal a las 72 hpi.
  • Los datos de qPCR confirmaron un aumento gradual en la biomasa fúngica, con un aumento brusco después de las 48 hpi en el grupo de dosis baja, validando las 36 hpi y 72 hpi como puntos temporales apropiados para analizar las fases de penetración y proliferación, respectivamente.

• Expresión Diferencial de Genes:

  • Un total de 182 genes mostraron una expresión diferencial significativa entre las dos etapas (ajuste $p < 0.05$).
  • 36 hpi (Etapa de Penetración): 83 genes fueron regulados al alza (DEGs36h). Estos se enriquecieron en proteínas extracelulares y hidrolasas. El análisis de Ontología Génica (GO) destacó términos relacionados con "Glucosidasas", "Unión de receptores de señalización" y "Respuesta a citocinas".
  • 72 hpi (Etapa de Proliferación): 99 genes fueron regulados al alza (DEGs72h). Estos genes abarcaron una gama más amplia de categorías funcionales sin un enriquecimiento significativo de términos GO, lo que sugiere una dispersión en diversas vías metabólicas.

• Identificación de Candidatos de Virulencia:

  • El estudio identificó 16 genes de virulencia previamente reportados entre los DEGs.
  • Los DEGs36h incluyeron homólogos asociados con la adhesión de la cutícula (Mad1), formación de apresorios (Gas1), evasión inmunitaria (Bps8), degradación de la cutícula (ChiV4) y procesos de infección (Bbnmo5, BbNoxA, cfp).
  • Los DEGs72h incluyeron genes involucrados en la síntesis de oosporina (OpS1, OpS2, OpS4–7), un factor de transcripción que regula el cambio morfológico (BbHCR1), un gen tipo perilipina (Mpl1) y un gen de peroxina (BbPex1).
  • Notablemente, mientras que Mpl1 es conocido por el metabolismo de lípidos en la formación de apresorios en Metarhizium robertsii, su homólogo mostró una alta expresión a las 72 hpi en este estudio, sugiriendo una función potencial alternativa en B. bassiana.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores presentan este estudio como el primero en describir el proceso de infección de B. bassiana cepa GHA contra TLBs e identificar genes con patrones de expresión que varían in vivo durante etapas de infección específicas en este huésped.

La significancia principal radica en demostrar la eficacia del análisis transcriptómico comparativo in vivo para la selección de genes de virulencia. Los hallazgos sugieren que, si bien las categorías funcionales de los genes expresados durante la etapa de penetración son análogas a las observadas en mosquitos (un modelo previo para la infección de B. bassiana), los perfiles de expresión génica específicos difieren a nivel de genes individuales. Esto indica que los mecanismos de virulencia pueden ser específicos de la cepa o del huésped.

El artículo concluye que estos genes identificados representan objetivos potenciales para investigaciones futuras destinadas a reducir selectivamente la virulencia de B. bassiana hacia depredadores beneficiosos como los TLB sin comprometer su eficacia contra especies de plagas, abordando así una debilidad crítica en las estrategias actuales de control biológico. Los autores declaran explícitamente que su objetivo futuro es validar estos candidatos mediante la inactivación (knockout) para lograr una reducción selectiva de la virulencia.