In vivo transcriptome analysis of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana strain GHA during infection against the beneficial predator tobacco leaf bug, Nesidiocoris tenuis (Hemiptera: Miridae)

Technische Samenvatting: In Vivo Transcriptoomanalyse van Beauveria bassiana Stam GHA Tijdens Infectie van Nesidiocoris tenuis

Probleemstelling
De entomopathogene schimmel Beauveria bassiana stam GHA is een commercieel mycocinsecticide dat breed wordt gebruikt voor biologische bestrijding. Een aanzienlijke beperking van deze stam is echter de hoge virulentie naar nuttige predatoren, specifiek de tabaksluis (Nesidiocoris tenuis, TLB), die in de landbouw wordt ingezet voor biologische plaagbestrijding. Hoewel het algemene infectiemechanisme van B. bassiana (penetratie van de cuticula gevolgd door proliferatie in het hemocoel) bekend is, blijven de specifieke moleculaire pathogeniteitsmechanismen en virulentiegenen die verantwoordelijk zijn voor de hoge mortaliteit bij TLB's nog onkarakteristiek. Het identificeren van deze specifieke virulentiefactoren is essentieel voor het ontwikkelen van strategieën om de effecten op niet-doelorganismen (zoals nuttige predatoren) te beperken, terwijl de effectiviteit tegen plagen behouden blijft.

Methodologie
De studie maakte gebruik van een meerfasige aanpak om het infectieproces te karakteriseren en stam-specifieke genexpressie te identificeren van B. bassiana stam GHA tijdens infectie van TLB's:

1. Infectiekinetiek en Microscopie:

   • Inoculatie: TLB's werden geïnoculeerd met conidiesuspensies bij twee concentraties ($5 \times 10^6$ en $5 \times 10^7$ conidia/mL).
   • Morfologische Observatie: Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en lichtmicroscopie werden gebruikt om conidiekieming, appressoriumvorming en hyfale invasie te observeren bij 12, 18, 24 en 36 uur na inoculatie (hpi). Met paraffine ingebedde secties, gekleurd met Grocott Methenamine Zilver, werd de interne schimmelgroei onderzocht bij 24, 36, 48, 72 en 96 hpi.
   • Kwantitatieve Groei Monitoring: Genomische kwantitatieve PCR (qPCR) gericht op de rDNA IGS-regio van stam GHA werd uitgevoerd op gastheer-DNA op verschillende tijdstippen om de accumulatie van schimmelbiomassa binnen de gastheer te kwantificeren.

2. Transcriptoomanalyse (RNA-seq):

   • Sampling: Op basis van de kinetische gegevens werden twee kritieke tijdstippen geselecteerd voor RNA-extractie: 36 hpi (dat de fase van cuticulapenetratie vertegenwoordigt) en 72 hpi (dat de fase van hemocoel-proliferatie vertegenwoordigt).
   • Sequencing: Totaal RNA werd geëxtraheerd uit gepoolde overlevende TLB's, waarna RNA-seq werd uitgevoerd. De reads werden gemapt naar het B. bassiana ARSEF 2860 referentiegenoom.
   • Differentieel Expressie Analyse: Genexpressieniveaus tussen de 36 hpi en 72 hpi stadia werden vergeleken met behulp van TMM-normalisatie en statistische testen (edgeR) om differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) te identificeren.
   • Functionele Annotatie: Genverrijkingsanalyse (Gene Ontology) en voorspellingen voor eiwitlokalisatie (Deep-Loc 2.1) werden uitgevoerd om de functionele rollen van de geïdentificeerde DEGs te karakteriseren.

Belangrijkste Resultaten

• Infectieprogressie:

  • Conidiekieming en appressoriumvorming werden bevestigd bij 12 hpi.
  • Invasieve hyfen werden voor het eerst gedetecteerd tijdens het penetreren van de cuticula bij 36 hpi.
  • Bij 48 hpi waren filamenteuze hyfen en hyfale lichamen nabij de cuticula waargenomen, die zich rond 72 hpi uitbreidden naar een groot deel van de lichaamsholte.
  • De qPCR-gegevens bevestigden een geleidelijke toename van de schimmelbiomassa, met een scherpe stijging na 4ks 48 hpi in de groep met de lagere dosis, wat de validatie vormt van 36 hpi en 72 hpi als geschikte tijdstippen voor het analyseren van respectievelijk de penetratie- en proliferatiefase.

• Differentieel Genexpressie:

  • In totaal vertoonden 182 genen een significante differentiële expressie tussen de twee stadia (gecorrigeerde $p < 0,05$).
  • 36 hpi (Penetratiefase): 83 genen waren opgereguleerd (DEGs36h). Deze waren verrijkt voor extracellulaire eiwitten en hydrolasen. Gene Ontology (GO)-analyse benadrukte termen gerelateerd aan "Glucosidasen", "Signaleringsreceptorbinding" en "Respons op cytokinen".
  • 72 hpi (Proliferatiefase): 99 genen waren opgereguleerd (DEGs72h). Deze genen verspreidden zich over een breder scala aan functionele categorieën zonder significante GO-term verrijking, wat wijst op een spreiding over diverse metabole routes.

• Identificatie van Virulentie-kandidaten:

  • De studie identificeerde 16 eerder gerapporteerde virulentiegenen onder de DEGs.
  • DEGs36h bevatten homologen geassocieerd met cuticula-adhesie (Mad1), appressoriumvorming (Gas1), immuunevasie (Bps8), cuticula-degradatie (ChiV4) en infectieprocessen (Bbnmo5, BbNoxA, cfp).
  • DEGs72h bevatten genen betrokken bij oosporeïne-synthese (OpS1, OpS2, OpS4–7), een transcriptiefactor die morfologische switching reguleert (BbHCR1), een perilipine-achtig gen (Mpl1) en een peroxine-gen (BbPex1).
  • Opvallend genoeg, hoewel Mpl1 bekend staat om lipidenmetabolisme bij appressoriumvorming in Metarhizium robertsii, vertoonde het homologon in deze studie een hoge expressie bij 72 hpi, wat suggereert dat er mogelijk een alternatieve functie is in B. bassiana.

Betekenis en Claims
De auteurs claimen dat deze studie de eerste is die het infectieproces van B. bassiana stam GHA tegen TLB's beschrijft en genen identificeert met expressiepatronen die in vivo variëren tijdens specifieke infectiestadia in deze gastheer.

De primaire betekenis ligt in het aantonen van de effectiviteit van vergelijkende in vivo transcriptoomanalyse voor het selecteren van virulentiegenen. De bevindingen suggereren dat, hoewel de functionele categorieën van de genen die tijdens de penetratiefase worden uitgedrukt analoog zijn aan die waargenomen in muggen (een eerder gebruikt model voor B. bassiana infectie), de specifieke genexpressieprofielen verschillen op het niveau van individuele genen. Dit geeft aan dat virulentiemechanismen gastheer- of stam-specifiek kunnen zijn.

Het artikel concludeert dat deze geïdentificeerde genen potentiële doelwitten vormen voor toekomstig onderzoek gericht op het selectief verminderen van de virulentie van B. bassiana naar nuttige predatoren zoals TLB's, zonder de effectiviteit tegen plaaspecies te ondermijnen, waarmee een kritiek zwak punt in huidige biologische bestrijdingsstrategieën wordt aangepakt. De auteurs geven expliciet aan dat hun toekomstige doel het valideren van deze kandidaten is door middel van 'knock-out' experimenten om een selectieve reductie van de virulentie te bereiken.