In vivo transcriptome analysis of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana strain GHA during infection against the beneficial predator tobacco leaf bug, Nesidiocoris tenuis (Hemiptera: Miridae)

Resumo Técnico: Análise do Transcriptoma In Vivo da Cepa GHA de Beauveria bassiana Durante a Infecção de Nesidiocoris tenuis

Definição do Problema
O fungo entomopatogênico Beauveria bassiana cepa GHA é um micoinseticida comercial amplamente utilizado para o controle de pragas. No entanto, uma limitação significativa desta cepa é sua alta virulência contra insetos predadores benéficos, especificamente o percevejo do tabaco (Nesidiocoris tenuis, TLB), que é utilizado na agricultura para o manejo biológico de pragas. Embora o mecanismo geral de infecção de B. bassiana (penetração da cutícula seguida de proliferação no hemocela) seja compreendido, os mecanismos moleculares de patogenicidade específicos e os genes de virulência responsáveis pela alta mortalidade observada em TLBs permanecem não caracterizados. A identificação desses fatores de virulência específicos é essencial para desenvolver estratégias que visem mitigar os efeitos sobre organismos não-alvo, como predadores benéficos, mantendo a eficácia contra as pragas.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem de múltiplos estágios para caracterizar o processo de infecção e identificar a expressão gênica específica de estágio em B. bassiana cepa GHA infectando TLBs:

1. Cinética de Infecção e Microscopia:

   • Inoculação: TLBs foram inoculados com suspensões de conídios em duas concentrações ($5 \times 10^6$ e $5 \times 10^7$ conídios/mL).
   • Observação Morfológica: Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de luz foram utilizadas para observar a germinação de conídios, formação de apressórios e invasão de hifas em 12, 18, 24 e 36 horas pós-inoculação (hpi). Seções embutidas em parafina coradas com Prata de Grocott Methenamine foram examinadas em 24, 36, 48, 72 e 96 hpi para rastrear o crescimento fúngico interno.
   • Monitoramento Quantitativo do Crescimento: O qPCR genômico visando a região rDNA IGS da cepa GHA foi realizado em DNA do hospedeiro em vários pontos temporais para quantificar o acúmulo de biomassa fúngica dentro do hospedeiro.

2. Análise Transcriptômica (RNA-seq):

   • Amostragem: Com base nos dados cinéticos, dois pontos críticos foram selecionados para extração de RNA: 36 hpi (representando o estágio de penetração da cutícula) e 72 hpi (representando o estágio de proliferação na hemocela).
   • Sequenciamento: RNA total foi extraído de grupos de TLBs sobreviventes, e o RNA-seq foi realizado. As leituras foram mapeadas para o genoma de referência B. bassiana ARSEF 2860.
   • Análise de Expressão Gênica Diferencial: Os níveis de expressão gênica entre os estágios de 36 hpi e 72 hpi foram comparados usando normalização TMM e testes estatísticos (edgeR) para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs).
   • Anotação Funcional: Análises de enriquecimento funcional (Gene Ontology) e previsões de localização de proteínas (Deep-Loc 2.1) foram conduzidas para caracterizar os papéis funcionais dos DEGs identificados.

Principais Resultados

• Progressão da Infecção:

  • A germinação de conídios e a formação de apressórios foram confirmadas por 12 hpi.
  • Hifas invasoras foram detectadas pela primeira vez penetrando a cutícula em 36 hpi.
  • Em 48 hpi, hifas filamentosas e corpos hifais foram observados próximos à cutícula, expandindo-se para uma ampla área da cavidade corporal até 72 hpi.
  • Os dados de qPCR confirmaram um aumento gradual na biomassa fúngica, com um aumento acentuado ocorrendo após 48 hpi no grupo de dose baixa, validando 36 hpi e 72 hpi como pontos temporais apropriados para analisar as fases de penetração e proliferação, respectivamente.

• Expressão Gênica Diferencial:

  • Um total de 182 genes apresentou expressão diferencial significativa entre os dois estágios (ajustado $p < 0,05$).
  • 36 hpi (Estágio de Penetração): 83 genes foram regulados positivamente (DEGs36h). Estes foram enriquecidos para proteínas extracelulares e hidrolases. A análise de Gene Ontology (GO) destacou termos relacionados a "Glicosidases", "Ligação de receptor de sinalização" e "Resposta a citocinas".
  • 72 hpi (Estágio de Proliferação): 99 genes foram regulados positivamente (DEGs72h). Esses genes abrangeram uma gama mais ampla de categorias funcionais sem enriquecimento significativo de termos de GO, sugerindo dispersão através de várias vias metabólicas.

• Identificação de Candidatos de Virulência:

  • O estudo identificou 16 genes de virulência previamente relatados entre os DEGs.
  • DEGs36h incluíram homólogos associados à adesão à cutícula (Mad1), formação de apressório (Gas1), evasão imune (Bps8), degradação da cutícula (ChiV4) e processos de infecção (Bbnmo5, BbNoxA, cfp).
  • DEGs72h incluíram genes envolvidos na síntese de oosporina (OpS1, OpS2, OpS4–7), um fator de transcrição que regula a mudança morfológica (BbHCR1), um gene do tipo perilipina (Mpl1) e um gene de peroxina (BbPex1).
  • Notavelmente, enquanto o Mpl1 é conhecido pelo metabolismo lipídico na formação de apressórios em Metarhizium robertsii, seu homólogo mostrou alta expressão em 72 hpi neste estudo, sugerindo uma função alternativa potencial em B. bassiana.

Significância e Alegações
Os autores reivindicam este estudo como o primeiro a descrever o processo de infecção de B. bassiana cepa GHA contra TLBs e a identificar genes com padrões de expressão que variam in vivo durante estágios específicos de infecção neste hospedeiro.

A principal significância reside em demonstrar a eficácia da análise transcriptômica comparativa in vivo para a seleção de genes de virulência. Os achados sugerem que, embora as categorias funcionais dos genes expressos durante o estágio de penetração em TLBs sejam análogas às observadas em mosquitos (um modelo anterior para infecção por B. bassiana), os perfis de expressão gênica específicos diferem no nível do gene individual. Isso indica que os mecanismos de virulência podem ser específicos de hospedeiro ou de cepa.

O artigo conclui que esses genes identificados representam alvos potenciais para pesquisas futuras visando reduzir seletivamente a virulência de B. bassiana em relação a predadores benéficos como os TLBs, sem comprometer sua eficácia contra espécies de pragas, abordando assim uma fraqueza crítica nas atuais estratégias de controle biológico. Os autores declaram explicitamente que seu objetivo futuro é validar esses candidatos através de nocaute (knockout) para alcançar a redução seletiva da virulência.