Widefield Nanodiamond Quantum Sensing Based on Light-Sheet Microscopy

기술 요약: 라이트 시트 현미경 기반의 광역장 나노다이아몬드 양자 센싱

문제 제기
질소-공석(NV) 센터를 포함하는 나노다이아몬드(ND)는 생체 적합성, 서브 마이크론 해상도, 그리고 온도, 자기장, 전기장 및 압력을 감지하는 능력을 갖추고 있어 생물학적 응용을 위한 강력한 양자 센서로 주목받고 있다. 그러나 실시간 세포 센싱에는 중요한 병목 현상이 존재하는데, 바로 고처리량 측정과 낮은 광독성 사이의 절충 관계이다. NV 센터의 표준 판독 방법인 광학 검출 자기 공명(ODMR)은 지속적인 레이저 조사(irradiation)를 필요로 한다. 기존의 광역장(widefield) ODMR은 샘플 전체 부피를 조명하여 초점 외 여기(out-of-focus excitation)를 유발하며, 이는 광독성(산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 및 DNA 손상)을 일으켜 장기적인 세포 생존력을 제한한다. 반대로, 공초점(confocal) ODMR은 점 스캐닝(point-scanning)을 통해 광독성을 최소화하지만, 체적(volumetric) 센싱을 하기에는 너무 느리며 여러 ND에 걸친 동시적인 공간적 상관관계를 포착할 수 없다. 전반사 형광(TIRF)은 여기 부피를 줄여주지만, 센싱 범위를 표면층으로 제한하여 3D 정보를 상실하게 만든다.

방법론
이러-이러한 한계를 해결하기 위해, 저자들은 라이트 시트 현미경(LSM)과 ND-ODMR을 통합한 광역장 양자 센싱 플랫폼(LSM-ODMR)을 개발하였다.

• 광학 구성: 시스템은 측면에 장착된 조명 대물렌즈를 사용하여 샘플 평면에 얇은 2차원 레이저 시트(NV 여기를 위한 532 nm 녹색광)를 투영한다. 형광은 직교하는 검출 대물렌즈를 통해 수집되며 sCMOS 카메라에 포착된다.
• 스캐닝 메커니즘: 레이저 시트는 $z$축을 따라 수직으로 이동할 수 있어, 샘플 자체를 스캐닝하지 않고도 광학적 단층 촬영(optical sectioning)과 3D 체적 스캐닝을 가능하게 한다.
• 샘플 핸들링: 커버슬립으로부터 발생하는 광학적 수차를 최소화하기 위해, 부착 세포 샘플은 기울어진 각도로 배치된다. 마이크로파 복사는 NV 스핀 상태를 조작하기 위해 안테나를 통해 전달된다.
• 센싱 모드: 시스템은 다음을 지원한다:
  1. ODMR 온도계: 제로 필드 분할 파라미터($D$)의 변화를 통한 온도 모니터링.
  2. $T_1$ 완화 측정법(Relaxometry): 스핀-격자 완화 시간(spin-lattice relaxation times)을 측정하기 위해 펄스 레이저 시퀀스를 사용하는 광역장 기술로, 자기 노이즈 및 활성 산소종(ROS)에 민감하다.

주요 기여

1. LSM-ODMR 통합: 고처리량과 광학적 단층 촬영을 결 одновременно 결합한, 실시간 세포 양자 센싱을 위한 LSM 기반의 최초 광역장 ODMR 시스템을 입증하였다.
2. 광독성 감소: 초점 외 여기를 제거함으로써, 기존의 광역장 조명과 비교하여 생물학적 샘플에 전달되는 레이저 선량을 크게 줄였다.
3. 감도 향향: 광학적 단층 촬영 능력은 초점 외 배경 형광(세포 자가 형광 또는 염색 시약에서 기인)을 억제하여 신호 대 잡음비(SNR)와 측정 감도를 개선한다.
4. 3D 다지점 센싱: 이 플랫폼은 점 스캐닝 방식의 한계를 극복하여, 3D 부피 내의 여러 ND에 대해 동시적이고 공간적으로 상관된 측정을 가능하게 한다.

결과

• 시스템 특성 분석: 라이트 시트 두께는 약 1.5 $\mu$m (FWHM)로 특성화되었으며, 24 $\mu$m의 횡방향 범위 내에서 2.1 $\mu$m 미만의 축 방향 해상도를 유지하여 전체 HeLa 세포를 이미징하기에 충분하였다.
• 아가로스 내 3D 이미징 및 센싱: 아가로스 겔에 매립된 ND를 사용하여, 시스템은 3D 이미징과 동시 다지점 온도 센싱을 달성하였다. 온도 감도는 개별 ND에 대해 약 2.9 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$로 측정되었으며, 78개의 ND 전체에 대한 중앙값은 4.47 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$였다.
• 실시간 세포 감도 비교: BCECF로 염색된 HeLa 세포에서, LSM-ODMR은 동일한 전력 밀도(~5 $\mu$W $\mu$m$^{-2}$)에서 기존 광역장 조명(8.87 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$)보다 우수한 감도(4.07 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$)를 보여주었다. LSM 방식은 염료로부터 오는 배경 간섭을 효과적으로 완화하였다.
• 광독성 평가: 동일한 레이저 전력 밀도 하에서, LSM으로 조사된 HeLa 세포는 최대 60분 동안 생존력을 유지한 반면(단 하나의 사망 사례 관찰), 광역장 조명 하의 세포는 20분 이내에 사멸하였다.
• 장기 모니터링:
  • ODMR: 시스템은 1시간 동안 세포 내 온도 변화를 성공적으로 모니터링하였으며, ND 유래 온도 트렌드는 외부 저항 온도 검출기(RTD)의 측정값과 밀접하게 일치하였다.
  • $T_1$ 완화 측정법: 광역장 $T_1$ 완화 측정법이 개발되어 살아있는 세포에 적용되었다. 세포 내 ND에 대한 $T_1$ 값의 연속적인 모니터링은 유의미한 변화 없이 최대 3시간 동안 지속되었으며, 이는 실험 전반에 걸친 세포 생존력을 확인해 주었다.

의의
본 논문은 LSM 기반의 광역장 나노다이아몬드 센싱 플랫폼이 낮은 광독성과 높은 공간 해상도를 요구하는 생물학적 연구를 위한 견고한 접근 방식을 제공한다고 주장한다. 초점 외 조명을 제거함으로써, 이 시스템은 실시간 세포의 가시적인 모니터링 창을 몇 시간까지 연장하여 세포 분열의 유사 분열 단계(mitotic phase)와 같은 확장된 생리적 과정을 조사할 수 있게 한다. 공간적 상관관계를 가진 동시적 3D 다중 모드 센싱(온도 및 $T_1$) 능력은 단일 지점 측정이나 높은 광독성과 관련된 인위적 현상 없이, 라디칼 수준이나 온도 변화를 서브셀룰러 수준에서 추적하는 것과 같은 역동적인 세포 내 과정에 대한 정량적, 장기적 연구를 위한 새로운 길을 제시한다. 저자들은 가우시안 라이트 시트가 회절 한계에 직면해 있지만, 향후 구현에서는 성능을 더욱 최적화하기 위해 스캐닝하지 않는 에어리(Airy) 라이트 시트를 활용할 수 있다고 언급하였다.