Widefield Nanodiamond Quantum Sensing Based on Light-Sheet Microscopy

Resumo Técnico: Sensoriamento Quântico com Nanodiamantes de Campo Amplo Baseado em Microscopia de Folha de Luz

Definição do Problema
Nanodiamantes (NDs) contendo centros de nitrogênio-vacância (NV) são sensores quânticos poderosos para aplicações biológicas devido à sua biocompatibilidade, resolução submicrométrica e capacidade de detectar temperatura, campos magnéticos, campos elétricos e pressão. No entanto, um gargalo crítico existe no sensoriamento de células vivas: o compromisso entre alta taxa de processamento (throughput) e baixa fototoxicidade. A ressonância magnética detectada opticamente (ODMR), o método de leitura padrão para centros NV, requer irradiação laser contínua. O ODMR de campo amplo convencional ilumina todo o volume da amostra, causando excitação fora do foco significativa, o que leva à fototoxicidade (estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e danos ao DNA), limitando a viabilidade a longo prazo. Por outro lado, o ODMR confocal minimiza a fototoxicidade através do escaneamento de ponto, mas é muito lento para o sensoriamento volumétrico e não consegue capturar correlações espaciais simultâneas entre múltiplos NDs. A fluorescência por reflexão total interna (TIRF) reduz o volume de excitação, mas restringe o sensoriamento às camadas superficiais, perdendo informações 3D.

Metodologia
Para abordar essas limitações, os autores desenvolveram uma plataforma de sensoriamento quântico de campo amplo integrando Microscopia de Folha de Luz (LSM) com ND-ODMR (LSM-ODMR).

• Configuração Óptica: O sistema emprega um objetivo de iluminação montado lateralmente para projetar uma folha de luz laser bidimensional fina (luz verde a 532 nm para excitação NV) no plano da amostra. A fluorescência é coletada ortogonalmente por um objetivo de detecção e capturada por uma câmera científica CMOS (sCMOS).
• Mecanismo de Escaneamento: A folha de luz é movível verticalmente ao longo do eixo $z$, permitindo o seccionamento óptico e o escaneamento volumétrico 3D sem escanear a própria amostra.
• Manipulação da Amostra: Para minimizar as aberrações ópticas da lamínula, as amostras de células aderentes são posicionadas em um ângulo inclinado. A radiação de micro-ondas é entregue via uma antena para manipular os estados de spin NV.
• Modalidades de Sensoriamento: O sistema suporta:
  1. Termometria ODMR: Monitoramento da temperatura através de deslocamentos no parâmetro de desdobramento de campo zero ($D$).
  2. Relaxometria $T_1$: Uma técnica de campo amplo usando sequências de laser pulsado para medir os tempos de relaxação spin-rede, sensíveis ao ruído magnético e espécies reativas de oxigênio (ROS).

Principais Contribuições

1. Integração LSM-ODMR: A primeira demonstração de um sistema de ODMR de campo amplo baseado em LSM para sensoriamento quântico em células vivas, combinando alto throughput com seccionamento óptico.
2. Redução da Fototoxicidade: Ao eliminar a excitação fora do foco, o sistema reduz significativamente a dose de laser entregue à amostra biológica em comparação com a iluminação de campo amplo convencional.
3. Sensibilidade Aprimorada: A capacidade de seccionamento óptico suprime a fluorescência de fundo fora do foco (da autofluorescência celular ou corantes de coloração), melhorando a relação sinal-ruído e a sensibilidade de medição.
4. Sensoriamento Multi-Ponto 3D: A plataforma permite medições simultâneas e espacialmente correlacionadas em múltiplos NDs dentro de um volume 3D, superando as limitações dos métodos de escaneamento de ponto.

Resultados

• Caracterização do Sistema: A espessura da folha de luz foi caracterizada em aproximadamente 1,5 $\mu$m (FWHM), mantendo uma resolução axial melhor que 2,1 $\mu$m sobre um intervalo lateral de 24 $\mu$m, o suficiente para imagear células HeLa inteiras.
• Imagem 3D e Sensoriamento em Agarose: Usando NDs incorporados em gel de agarose, o sistema alcançou imagem 3D e sensoriamento de temperatura multi-ponto simultâneo. A sensibilidade de temperatura foi medida em aproximadamente 2,9 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$ para NDs individuais, com uma sensibilidade mediana de 4,47 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$ através de 78 NDs.
• Comparação de Sensibilidade em Células Vivas: Em células HeLa coradas com BCECF, o LSM-ODMR demonstrou sensibilidade superior (4,07 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$) comparado à iluminação de campo amplo convencional (8,87 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$) sob densidades de potência idênticas (~5 $\mu$W $\mu$m$^{-2}$). O método LSM mitigou efetivamente a interferência de fundo do corante.
• Avaliação de Fototoxicidade: Sob densidades de potência de laser idênticas, as células HeLa iluminadas com LSM permaneceram viáveis por até 60 minutos (com apenas uma morte observada), enquanto as células sob iluminação de campo amplo morreram em 20 minutos.
• Monitoramento de Longo Prazo:
  • ODMR: O sistema monitorou com sucesso mudanças de temperatura intracelular durante uma hora, com as tendências de temperatura derivadas dos NDs correspondendo estreitamente às leituras de um detector de temperatura de resistência externa (RTD).
  • Relaxometria $T_1$: Um método de relaxometria $T_1$ de campo amplo foi desenvolvido e aplicado a células vivas. O monitoramento contínuo dos valores de $T_1$ para NDs intracelulares foi sustentado por até três horas sem que mudanças significativas fossem detectadas, confirmando a viabilidade celular durante todo o experimento.

Significância
O artigo afirma que esta plataforma de sensoriamento com nanodiamantes baseada em LSM fornece uma abordagem robusta para estudos biológicos que exigem baixa fototoxicidade e alta resolução espacial. Ao eliminar a iluminação fora do foco, o sistema estende a janela de monitoramento viável para células vivas por várias horas, permitindo a investigação de processos fisiológicos estendidos, como a fase mitótica da divisão celular. A capacidade de realizar sensoriamento multimodal 3D e simultâneo (temperatura e $T_1$) com correlação espacial oferece um novo caminho para estudos quantitativos de longo prazo de processos intracelulares dinâmicos, como o rastreamento de níveis de radicais ou flutuações de temperatura no nível subcelular, sem os artefatos associados a medições de ponto único ou alta fototoxicidade. Os autores observam que, embora as folhas de luz Gaussianas enfrentem limites de difração, implementações futuras poderiam utilizar folhas de luz de Airy não varredoras para otimizar ainda mais o desempenho.