Widefield Nanodiamond Quantum Sensing Based on Light-Sheet Microscopy

技術要約：ライトシート顕微鏡に基づく広視野ナノダイヤモンド量子センシング

問題提起
窒素空孔（NV）中心を含むナノダイヤモンド（ND）は、その生体適合性、サブミクロン解像度、および温度、磁場、電場、圧力を検出する能力により、生物学的応用における強力な量子センサーである。しかし、ライブセル・センシングにおいて、高スループットな測定と低フォトトキシシティ（光毒性）の間のトレードオフが重大なボトルネックとなっている。NV中心の標準的な読み出し手法である光検出磁気共鳴（ODMR）は、連続的なレーザー照射を必要とする。従来の広視野ODMRはサンプル体積全体を照射するため、焦点外の励起を大量に発生させ、それがフォトトキシシティ（酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全、DNA損傷）を引き起こし、長期的な生存性を制限する。対照的に、共焦点ODMRは点走査によってフォトトキシシティを最小限に抑えるが、体積センシングには遅すぎ、複数のND間にわたる同時的な空間相関を捉えることはできない。全反射蛍光（TIRF）は励起体積を減少させるが、表面層に限定されるため、3D情報は失われる。

手法
これらの制限に対処するため、著者らはライトシート顕微鏡（LSM）とND-ODMRを統合した広視野量子センシングプラットフォーム（LSM-ODMR）を開発した。

• 光学構成: 本システムは、サイドマウント型の照明対物レンズを用いて、サンプルの平面内に薄い2次元レーザーシート（NV励起用の532 nmの緑色光）を投影する。蛍光は直交する検出対物レンズによって収集され、科学CMOS（sCMC）カメラによってキャプチャされる。
• 走査メカニズム: ライトシートは$z$軸方向に垂直に移動可能であり、サンプル自体を走査することなく、光学セクショニングと3D体積走査を可能にする。
• サンプルハンドリング: カバーガラスによる光学収差を最小限に抑えるため、付着細胞サンプルは傾斜角を持って配置される。NVスピン状態を操作するために、アンテナを介してマイクロ波放射が供給される。
• センシング・モダリティ: システムは以下の機能をサポートする：
  1. OD_MR温度計: ゼロ磁場分裂パラメータ（$D$）のシフトを通じて温度をモニタリングする。
  2. $T_1$緩和法: パルスレーザーシーケンスを用いてスピン格子緩和時間を測定する広視野技術であり、磁気ノイズや活性酸素種（ROS）に対して敏感である。

主な貢献

1. LSM-ODMRの統合: 高スループットと光学セクショニングを組み合わせた、ライブセル量子センシングのためのLSMベースの広視野ODMRシステムの初の実証。
2. フォトトキシシティの低減: 焦点外の励起を排除することにより、本システムは従来の広視野照明と比較して、生物学的サンプルに delivered されるレーザー線量を大幅に削減する。
3. 感度の向上: 光学セクショニング機能により、焦点外の背景蛍光（細胞の自家蛍光や染色剤によるもの）が抑制され、信号対雑音比（S/N比）と測定感度が向上する。
4. 3Dマルチポイント・センシング: 本プラットフォームは、3D体積内の複数のNDにわたる同時かつ空間的に相関した測定を可能にし、点走査法の限界を克服する。

結果

• システム特性評価: ライトシートの厚さは約1.5 $\mu$m（FWHM）と特性評価され、24 $\mu$mの横方向範囲にわたって2.1 $\mu$m未満の軸方向分解度を維持しており、HeLa細胞全体のイメージングに十分である。
• アガロース内での3Dイメージングとセンシング: アガロースゲルに埋め込まれたNDを用い、システムは3Dイメージングと同時マルチポイント温度センシングを実現した。温度感度は個々のNDに対して約2.9 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$、78個のND全体での中央値は4.47 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$であった。
• ライブセルにおける感度比較: BCECF染色されたHeLa細胞において、LSM-ODMRは、同一のパワー密度（~5 $\mu$W $\mu$m$^{-2}$）において、従来の広視野照明（8.87 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$）よりも優れた感度（4.07 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$）を示した。LSM法は、染料による背景干渉を効果的に軽減した。
• フォトトキシシティ評価: 同一のレーザーパワー密度下で、LSMで照射されたHeLa細胞は最大60分間生存していた（死亡は1例のみ）のに対し、広視野照明下の細胞は20分以内に死亡した。
• 長期モニタリング:
  • ODMR: システムは、1時間の細胞内温度変化のモニタリングに成功し、ND由来の温度トレンドは外部の抵抗温度検出器（RTD）の読み取り値と密接に一致した。
  • $T_1$緩和法: ライブセルに適用可能な広視野$T_1$緩和法が開発された。細胞内NDの$T_1$値の連続的なモニタリングは、最大3時間まで維持され、実験中を通して有意な変化は検出されず、細胞の生存性が確認された。

意義
本論文は、このLSMベースの広視野ナノダイヤモンドセンシングプラットフォームが、低フォトトキシシティと高空間分解能を必要とする生物学的研究のための堅牢なアプローチを提供すると主張している。焦点外の照明を排除することで、本システムはライブセルの生存モニタリングウィンドウを数時間にまで延長し、細胞分裂の有糸分裂相のような長期的な生理学的プロセスの調査を可能にする。同時かつ3D、マルチモーダルなセンシング（温度および$T_1$）を実行できる能力は、単一点測定や高フォトトキシシティに伴うアーティファクトなしに、動的な細胞内プロセス（ラジカルレベルや温度変動の追跡など）の定量的かつ長期的な研究への新しい道を開く。著者らは、ガウス型ライトシートは回折限界に直面するものの、将来的な実装では、性能をさらに最適化するために非走査型エアリー・ライトシートを利用できる可能性があると述べている。