Widefield Nanodiamond Quantum Sensing Based on Light-Sheet Microscopy

Resumen Técnico: Sensores Cuánticos de Nanodiamantes de Campo Amplio Basados en Microscopía de Lámina de Luz

Planteamiento del Problema
Los nanodiamantes (ND) que contienen centros de nitrógeno-vacante (NV) son potentes sensores cuánticos para aplicaciones biológicas debido a su biocompatibilidad, resolución submicrónica y capacidad para detectar temperatura, campos magnéticos, campos eléctricos y presión. Sin embargo, existe un cuello de botella crítico en la detección en células vivas: el compromiso entre la alta capacidad de procesamiento (throughput) y la baja fototoxicidad. La resonancia magnética detectada ópticamente (ODMR), el método de lectura estándar para los centros NV, requiere una irradiación láser continua. El ODMR de campo amplio convencional ilumina todo el volumen de la muestra, lo que provoca una excitación fuera de foco significativa que conduce a la fototoxicidad (estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y daño al ADN), limitando la viabilidad a largo plazo. Por el contrario, el ODMR confocal minimiza la fototoxicidad mediante el escaneo de puntos, pero es demasiado lento para la detección volumétrica y no puede capturar correlaciones espaciales simultáneas en múltiples ND. La fluorescencia por reflexión total interna (TIRF) reduce el volumen de excitación, pero restringe la detección a las capas superficiales, perdiendo la información 3D.

Metodología
Para abordar estas limitaciones, los autores desarrollaron una plataforma de detección cuántica de campo amplio que integra la microscopía de lámina de luz (LSM) con el ND-ODMR (LSM-ODMR).

• Configuración Óptica: El sistema emplea un objetivo de iluminación montado lateralmente para proyectar una fina lámina de luz láser bidimensional (luz verde a 532 nm para la excitación de NV) en el plano de la muestra. La fluorescencia se recolecta ortogonalmente mediante un objetivo de detección y es capturada por una cámara científica CMOS (sCMOS).
• Mecanismo de Escaneo: La lámina de luz es desplazable verticalmente a lo largo del eje $z$, lo que permite el seccionamiento óptico y el escaneo volumétrico 3D sin desplazar la muestra.
• Manipulación de la Muestra: Para minimizar las aberraciones ópticas del cubreobjetos, las muestras de células adherentes se posicionan en un ángulo inclinado. La radiación de microondas se suministra mediante una antena para manipular los estados de espín de los NV.
• Modalidades de Detección: El sistema soporta:
  1. Termometría ODMR: Monitoreo de la temperatura mediante cambios en el parámetro de desdoblamiento de campo cero ($D$).
  2. Relajación $T_1$: Una técnica de campo amplio que utiliza secuencias de pulsos láser para medir los tiempos de relajación espín-red, sensibles al ruido magnético y a las especies reactivas de oxígeno (ROS).

Contribuciones Clave

1. Integración LSM-ODMR: La primera demostración de un sistema de ODMR de campo amplio basado en LSM para la detección cuántica en células vivas, combinando alta capacidad de procesamiento con seccionamiento óptico.
2. Reducción de la Fototoxicidad: Al eliminar la excitación fuera de foco, el sistema reduce significativamente la dosis de láser entregada a la muestra biológica en comparación con la iluminación convencional de campo amplio.
3. Sensibilidad Mejorada: La capacidad de seccionamiento óptico suprime la fluorescencia de fondo fuera de foco (de la autofluorescencia celular o de colorantes de tinción), mejorando la relación señal-ruido y la sensibilidad de la medición.
4. Detección Multipunto 3D: La plataforma permite mediciones simultáneas y espacialmente correlacionadas en múltiples ND dentro de un volumen 3D, superando las limitaciones de los métodos de escaneo de puntos.

Resultados

• Caracterización del Sistema: El espesor de la lámina de luz se caracterizó en aproximadamente 1.5 $\mu$m (FWHM), manteniendo una resolución axial mejor que 2.1 $\mu$m sobre un rango lateral de 24 $\mu$m, suficiente para la imagen de células HeLa completas.
• Imagen y Detección 3D en Agarosa: Utilizando ND embebidos en gel de agarosa, el sistema logró la obtención de imágenes 3D y la detección simultánea de temperatura en múltiples puntos. La sensibilidad térmica se midió en aproximadamente 2.9 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$ para ND individuales, con una sensibilidad mediana de 4.47 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$ a través de 78 ND.
• Comparación de Sensibilidad en Células Vivas: En células HeLa teñidas con BCECF, el LSM-ODMR demostró una sensibilidad superior (4.07 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$) comparado con la iluminación de campo amplio convencional (8.87 K $\sqrt{\text{Hz}}^{-1}$) a densidades de potencia idénticas (~5 $\mu$W $\mu$m$^{-2}$). El método LSM mitigó eficazmente la interferencia de fondo del colorante.
• Evaluación de la Fototoxicidad: Bajo densidades de potencia de láser idénticas, las células HeLa iluminadas con LSM permanecieron viables hasta por 60 minutos (observándose solo una muerte), mientras que las células bajo iluminación de campo amplio murieron en 20 minutos.
• Monitoreo a Largo Plazo:
  • ODMR: El sistema monitoreó con éxito los cambios de temperatura intracelular durante una hora, con tendencias de temperatura derivadas de los ND que coincidieron estrechamente con las lecturas de un detector de temperatura de resistencia (RTD) externo.
  • Relajación $T_1$: Se desarrolló y aplicó un método de relajación $T_1$ de campo amplio a células vivas. El monitoreo continuo de los valores de $T_1$ para los ND intracelulares se mantuvo hasta por tres horas sin que se detectaran cambios significativos, confirmando la viabilidad celular durante todo el experimento.

Significancia
El artículo afirma que esta plataforma de detección de nanodiamantes basada en LSM proporciona un enfoque robusto para estudios biológicos que requieren baja fototoxicidad y alta resolución espacial. Al eliminar la iluminación fuera de foco, el sistema extiende la ventana de monitoreo viable para células vivas a varias horas, permitiendo la investigación de procesos fisiológicos extendidos como la fase mitótica de la división celular. La capacidad de realizar detección multimodal 3D y simultánea (temperatura y $T_1$) con correlación espacial ofrece una nueva vía para estudios cuantitativos y a largo plazo de procesos intracelulares dinámicos, como el seguimiento de niveles de radicales o fluctuaciones de temperatura a nivel subcelular, sin los artefactos asociados con las mediciones de punto único o la alta fototoxicidad. Los autores señalan que, aunque las láminas de luz gaussianas enfrentan límites de difracción, las implementaciones futuras podrían utilizar láminas de luz de Airy sin escaneo para optimizar aún más el rendimiento.