Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues
طوّر المؤلفون تقنية "تخطيط طبقات ما قبل النحت الأيوني المركزة" (PLCT)، وهي سير عمل متكامل يجمع بين التجميد عالي الضغط المعدل والنحت الأيوني القائم على البلازما لتمكين التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد عالي الدقة، والمحدد للعمق، للأنسجة متعددة الطبقات مثل الشبكية، حيث كشف بنجاح عن البنى الفائقة الأصلية مثل الخيوط العصبية والأشرطة المشبكية.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
لرؤية آليات الحياة وهي تعمل، اعتمد العلماء لفترة طويلة على تقنية تسمى التصوير المقطعي بالإلكترون البردي (cryo-electron tomography). تخيل أنك تحاول فهم كيفية عمل آلة معقدة عن طريق تفكيكها، ولكن بدلاً من تفكيكها، تقوم بتجميدها فوراً لتبقى تماماً كما كانت أثناء تشغيلها. هذه الطريقة، المعروفة بالتصوير المقطعي بالإلكترون البردي، تسمح للباحثين بالتقاط صور ثلاثية الأبعاد للخلايا وأجزائها الداخلية في حالة تكاد تكون مطابقة لكيفية وجودها في الطبيعة. ومن خلال تجميد العينات بسرعة كبيرة تجعل الماء بداخلها يتحول إلى مادة صلبة زجاجية بدلاً من تكوين بلورات ثلجية ضارة، يمكن للعلماء التحديق في الداخل دون التشوهات الناتجة عن المواد الحافظة الكيميائية التقليدية. ومع ذلك، فقد اصطدمت هذه الأداة القوية بحائط مسدود عندما يتعلق الأمر بالأنسجة السميكة والطبقية مثل شبكية العين البشرية. فبينما تعمل هذه التقنية بشكل رائع مع الخلايا الفردية الرقيقة، فإنها تعاني مع العينات الأكثر سمكاً حيث تكون عملية التجميد غير متساوية وتكون الهياكل المستهدفة مدفونة بعمق يصعب الوصول إليه باستخدام أدوات القطع الحالية.
لقد طور فريق من الباحثين في جامعة ونتشو الطبية والأكاديمية الصينية للعلوم الآن طريقة جديدة لاختراق هذا الحاجز. لقد ابتكروا طريقة أطلقوا عليها اسم "تصوير الطبقات عبر خريطة الـ FIB المسبقة" (Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography أو PLCT)، والتي تعمل بمثابة خريطة دقيقة ودليل جراحي في آن واحد. كان هدفهم هو فحص الشبكية، وهي الأنسجة الحساسة للضوء الموجودة في الجزء الخلفي من العين، والتي تتكون من عشر طبقات متميزة. وبشكل محدد، أرادوا فحص المشابك العصبية، وهي الوصلات الصغيرة التي تتواصل من خلالها الخلايا العصبية مع بعضها البعض، والتي تقع في عمق منتصف هذا النسيج. إن المحاولات السابقة لتجميد وتقطيع مثل هذا النسيج السميك غالباً ما كانت تؤدي إلى تكون بلورات ثلجية تحطم الهياكل الدقيقة أو تفشل في الوصول إلى الطبقة المستهدفة تماماً. أدرك الباحثون أنه لرؤية هذه الطبقات العميقة بوضوح، كان عليهم أولاً تغيير كيفية تحضير العينة، وذلك بتحويل كتلة سميكة من النسيج إلى شريط يمكن التحكم فيه قبل تجميده.
تبدأ العملية بعين فأر. فبدلاً من محاولة تجميد الشبكية بأكملها، والتي يبلغ سمكها حوالي 200 ميكرومتر، قام الباحثون بقصها بعناية إلى شرائط رفيعة، يقل عرض كل منها عن 100 ميكرومتر. ثم قاموا بتجميد هذه الشرائط بشكل خاطف باستخدام التجميد عالي الضغط، وهي تقنية تحول الماء داخل النسيج إلى حالة زجاجية دون تكوين بلورات ثلجية. كانت هذه الخطوة حاسمة؛ إذ فشلت المحاولات السابقة لتجميد الشبكية بأكملها دفعة واحدة بسبب تكون البلورات الثلجية في المركز، مما دمر الهياكل التي أرادوا دراستها. وبمجرد تجميدها، استخدم الفريق سكيناً متخصصاً لتقليم الشرائط بشكل أكبر، وإزالة الحواف الخارجية لترك شريحة مسطحة ونظيفة بسمك يتراوح بين 30 إلى 50 ميكرومتر. هذه الخطوة الوسيطة جسرت الفجوة بين قطعة النسيج السميكة والشريحة فائقة الرقة المطلوبة للتصوير عالي الدقة.
إلا أن الابتكار الحقيقي يكمن في كيفية العثور على المكان الصحيح للنظر. ولأن الشبكية طبقية مثل الكعكة، مع وجود أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في كل طبقة، فقد احتاج الباحثون إلى معرفة مكان القطع بالضبط. استخدموا الطبقات المرئية للنسيج، مثل الطبقة النووية الخارجية والطبقة النووية الداخلية، كعلامات استرشادية للملاحة. ومن خلال قياس موضع هذه الطبقات بالنسبة لحواف العينة، تمكنوا من حساب الموقع الدقيق للطبقة الضفيرية الخارجية. هذه هي الطبقة التي تتصل فيها الخلايا المستقبلة للضوء مع الخلاء العصبية الأخرى، وتقع على عمق يتراوح بين 90 إلى 100 ميكرومتر تقريباً في النسيج الأصلي. وباستخدام هذه الخريطة، وجهوا شعاع أيونات مركّز، وهو أداة تستخدم تياراً من الذرات المشحونة لنحت المادة، لنحت نافذة رقيقة عند ذلك العمق المحدد تماماً. سمح هذا بكشف المشابك العصبية دون قطع الطبقات الخاطئة أو تفويت الهدف تماماً.
بعد تحضير العينة، استخدم الفريق مجهراً إلكترونياً لالتقاط آلاف الصور من زوايا مختلفة ودمجها في نموذج ثلاثي الأبعاد. وما وجدوه كان رؤية واضحة للآلات الخلوية في حالتها الطبيعية. لقد حددوا الأنابيب الدقيقة، التي تشبه السقالات الداخلية للخلية، وحللوا هيكلها إلى مستوى من التفصيل أظهر 13 خيطاً مرتبة في دائرة. والأكثر إثارة للدهشة، هو أنهم وجدوا نوعاً مختلفاً من الخيوط، والذي حددوه على أنه خيوط عصبية. ظهرت هذه الهياكل كحزم رفيعة تشبه الحبال بقطر يبلغ حوالي 10 نانومتر. وكشفت الصور أن هذه الخيو filaments لها شكل محدد، حيث يلتف ستة خيوط حول مركز، وهو نمط يطابق ما هو معروف عن الخيوط العصبية في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي. وكانت هذه هي المرة الأولى التي تُرى فيها هذه الهياكل بهذا القدر من التفصيل داخل الأنسجة الحية للشبكية.
كما نظر الباحثون أيضاً في الأشرطة المشبكية، وهي الهياكل المتخصصة التي تساعد الخلايا العصبية على إطلاق الإشارات الكيميائية. وفي إعادة البناء ثلاثية الأبعاد، لم تبدُ هذه الأشرطة كقضبان بسيطة، بل ظهرت كمجموعة من الوحدات الصغيرة الشبيهة بالكتل المرصوصة فوق بعضها البعض في صفوف متوازية، مما يشبه نمط البلاط. هذا الهيكل الدقيق، الذي لم يُرَ بهذا الوضوح من قبل، يشير إلى طريقة منظمة للغاية لتعبئة الآلات اللازمة للتواصل السريع بين الخلايا. وتؤكد القدرة على رؤية هذه التفاصيل أن طريقتهم الجديدة تنتج عينات ذات جودة عالية بما يكفي للكشف عن البنية الحقيقية للخلية، بعيداً عن تشوهات الجليد أو المعالجة الكيميائية.
يُظهر هذا العمل أنه من الممكن دراسة الطبقات العميقة للأنسجة المعقدة دون فقدان سلامة العينة. ومن خلال الجمع بين استراتيجية قص دقيقة وملاحة محكمة، فتح الباحثون نافذة على العمليات الداخلية للشبكية كانت مغلقة سابقاً. وبينما كان تركيزهم الحالي على عين الفأر، فإن الطريقة التي طوروها لا تقتصر على هذا النسيج وحده. إذ يمكن تطبيق نفس مبادئ الترقق، ورسم الخرائط، والقطع المستهدف على أعضاء أخرى متعددة الطبقات، مثل الدماغ أو الحبل الشوكي. وبالنسبة للعلماء الذين كانوا ينتظرون رؤية التفاصيل الجزيئية لكيفية عمل هذه الأنسجة في حالتها الطبيعية، فإن هذا النهذا الجديد يقدم مساراً موثوقاً، محولاً تحدياً كان مستحيلاً في السابق إلى إجراء روتيني.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.