Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues

जीवन की मशीनरी को क्रियाशील रूप में देखने के लिए, वैज्ञानिक लंबे समय से 'क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी' नामक तकनीक पर भरोसा करते आए हैं। कल्पना कीजिए कि आप एक जटिल मशीन को समझने की कोशिश कर रहे हैं उसे अलग-अलग करके, लेकिन उसे अलग करने के बजाय, आप उसे तुरंत जमा देते हैं ताकि वह बिल्कुल वैसी ही रहे जैसी वह चलते समय थी। यह विधि, जिसे क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी कहा जाता है, शोधकर्ताओं को कोशिकाओं और उनके आंतरिक भागों की तीन-आयामी तस्वीरें ऐसी अवस्था में लेने की अनुमति देती है जो लगभग वैसी ही होती है जैसी वे प्रकृति में मौजूद हैं। नमूनों को इतनी तेज़ी से जमाने से कि उनके अंदर का पानी हानिकारक बर्फ के क्रिस्टल बनाने के बजाय कांच जैसे ठोस में बदल जाए, वैज्ञानिक पारंपरिक रासायनिक संरक्षकों द्वारा उत्पन्न विकृतियों के बिना उनके भीतर झांक सकते हैं। हालाँकि, यह शक्तिशाली उपकरण मानव रेटिना जैसे मोटे, स्तरित ऊतकों (tissues) के मामले में एक दीवार से टकरा गया है। जहाँ यह पतली, एकल कोशिकाओं के लिए खूबसूरती से काम करता है, वहीं यह उन मोटे नमूनों के साथ संघर्ष करता है जहाँ जमने की प्रक्रिया असमान होती है और लक्षित संरचनाएं वर्तमान कटाई उपकरणों तक पहुँचने के लिए बहुत गहरी दबी होती हैं।

वेन्ज़ौ मेडिकल यूनिवर्सिटी और चीनी विज्ञान अकादमी के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब इस बाधा को तोड़ने का एक नया तरीका विकसित किया है। उन्होंने एक विधि बनाई जिसे वे 'प्री-फाइब लेयर-मैपिंग क्रायो टोमोग्राफी' या PLCT कहते हैं, जो एक सटीक मानचित्र और एक सर्जिकल गाइड के संयोजन की तरह कार्य करती है। उनका लक्ष्य रेटिना को देखना था, जो आँख के पीछे का प्रकाश-संवेदनशील ऊतक है, जो दस विशिष्ट परतों में व्यवस्थित है। विशेष रूप से, वे सिनैप्स (synapses) की जांच करना चाहते थे, जो वे छोटे जोड़ हैं जहाँ तंत्रिका कोशिकाएं एक-दूसरे से बात करती हैं, और जो इस ऊतक के बीच में गहराई में स्थित होते हैं। ऐसे मोटे ऊतक को जमाने और काटने के पिछले प्रयास अक्सर ऐसे परिणाम देते थे जहाँ बर्फ के क्रिस्टल ने नाजुक संरचनाओं को तोड़ दिया या लक्षित परत को पूरी तरह से मिस कर दिया। शोधकर्ताओं ने महसूस किया कि इन गहरी परतों को स्पष्ट रूप से देखने के लिए, उन्हें पहले नमूने तैयार करने के तरीके को बदलना होगा, यानी एक मोटे ऊतक के ब्लॉक को जमाने से पहले एक प्रबंधनीय पट्टी में बदलना होगा।

यह प्रक्रिया एक चूहे की आँख से शुरू होती है। पूरे रेटिना को जमाने के बजाय, जो लगभग 200 माइक्रोमीटर मोटा होता है, शोधकर्ताओं ने इसे सावधानीपूर्वक पतली पट्टियों में काट दिया, जिनमें से प्रत्येक 100 माइक्रोमीटर से कम चौड़ी है। फिर उन्होंने इन पट्टियों को हाई-प्रेशर फ्रीजिंग का उपयोग करके फ्लैश-फ्रीज किया, एक ऐसी तकनीक जो ऊतक के भीतर के पानी को बर्फ के क्रिस्टल बनाए बिना कांच जैसी अवस्था में बदल देती है। यह कदम महत्वपूर्ण था; पूरे रेटिना को एक साथ जमाने के पिछले प्रयास विफल रहे थे क्योंकि केंद्र में बर्फ के क्रिस्टल बन गए थे, जिससे वे संरचनाएं नष्ट हो गईं जिनका वे अध्ययन करना चाहते थे। जमने के बाद, टीम ने पट्टियों को और अधिक छोटा करने के लिए एक विशेष चाकू का उपयोग किया, बाहरी किनारों को हटाकर लगभग 30 से 50 माइक्रोमीटर मोटी एक साफ, सपाट स्लैब छोड़ी। यह मध्यवर्ती चरण एक मोटे ऊतक के टुकड़े और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए आवश्यक अत्यंत-पतले स्लाइस के बीच के अंतर को पाटता है।

हालाँकि, वास्तविक नवाचार इस बात में निहित है कि उन्होंने सही जगह कैसे ढूंढी। चूंकि रेटिना एक केक की तरह परतों में व्यवस्थित है, जिसमें प्रत्येक परत में विभिन्न प्रकार की तंत्रिका कोशिकाएं होती हैं, इसलिए शोधकर्ताओं को यह जानने की आवश्यकता थी कि वे कहाँ काट रहे हैं। उन्होंने ऊतक की दृश्यमान परतों, जैसे कि बाहरी परमाणु परत (outer nuclear layer) और आंतरिक परमाणु परत (inner nuclear layer) का उपयोग लैंडमार्क के रूप में नेविगेट करने के लिए किया। नमूने के किनारों के सापेक्ष इन परतों की स्थिति को मापकर, वे सटीक गणना कर सके कि बाहरी प्लेक्सिफॉर्म परत (outer plexiform layer) कहाँ स्थित है। यह वह परत है जहाँ फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं अन्य तंत्रिका कोशिकाओं के साथ जुड़ती हैं, और यह मूल ऊतक में लगभग 90 से 100 माइक्रोमीटर गहरा स्थित है। इस मानचित्र का उपयोग करते हुए, उन्होंने एक फोकस्ड आयन बीम (focused ion beam) को निर्देशित किया, जो एक ऐसा उपकरण है जो आवेशित परमाणुओं की एक धारा का उपयोग करके सामग्री को तराशता है, ताकि उस विशिष्ट गहराई पर एक पतला विंडो बनाया जा सके। इसने उन्हें गलत परतों को काटे बिना या लक्ष्य को पूरी तरह से मिस किए बिना सिनैप्स को उजागर करने की अनुमति दी।

नमूना तैयार होने के बाद, टीम ने विभिन्न कोणों से हजारों चित्र लेने और उन्हें एक तीन-आयामी मॉडल में जोड़ने के लिए इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया। उन्होंने पाया कि उन्हें प्राकृतिक अवस्था में कोशिकीय मशीनरी का एक स्पष्ट दृश्य मिला। उन्होंने माइक्रोट्यूब्यूल्स (microtubules) की पहचान की, जो कोशिका के आंतरिक मचान (scaffolding) की तरह होते हैं, और उनके संरचना को इतने विस्तृत स्तर तक हल किया जो 13 धागों के एक घेरे में व्यवस्थित होने को दर्शाता है। अधिक आश्चर्यजनक रूप से, उन्होंने एक अलग प्रकार के फिलामेंट भी पाए, जिन्हें उन्होंने न्यूरोफिलामेंट्स (neurofilaments) के रूप में पहचाना। ये संरचनाएं लगभग 10 नैनोमीटर व्यास वाले पतले, रस्सी जैसे बंडलों के रूप में दिखाई दीं। चित्रों ने खुलासा किया कि इन फिलामेंट्स का एक विशिष्ट आकार था, जिसमें छह धागे एक केंद्रीय कोर के चारों ओर लिपटे हुए थे, एक पैटर्न जो तंत्रिका तंत्र के अन्य हिस्सों में न्यूरोफिलामेंट्स के बारे में ज्ञात है उससे मेल खाता था। यह पहली बार था जब इन संरचनाओं को रेटिना के जीवित ऊतक के भीतर इतने विस्तार से देखा गया था।

शोधकर्ताओं ने सिनैप्टिक रिबन्स (synaptic ribbons) को भी देखा, जो वे विशेष संरचनाएं हैं जो तंत्रिका कोशिकाओं को रासायनिक संकेत छोड़ने में मदद करती हैं। उनके तीन-आयामी पुनर्निर्माण में, ये रिबन्स साधारण छड़ों की तरह नहीं दिखे। इसके बजाय, वे समानांतर पंक्तियों में एक साथ रखे गए छोटे, ब्लॉक जैसे इकाइयों की एक श्रृंखला के रूप में दिखाई दिए, जो टाइल्स के पैटर्न जैसा दिखता है। यह सूक्ष्म संरचना, जिसे पहले इतनी स्पष्टता से नहीं देखा गया था, यह सुझाव देती है कि कोशिकाओं के बीच तीव्र संचार के लिए आवश्यक मशीनरी को पैक करने का एक अत्यधिक संगठित तरीका है। इन विवरणों को देखने की क्षमता यह पुष्टि करती है कि उनकी नई विधि उच्च गुणवत्ता वाले नमूने उत्पन्न करती है जो बर्फ या रासायनिक उपचार की विकृतियों से मुक्त होकर कोशिका की वास्तविक वास्तुकला को प्रकट करती है।

यह कार्य यह प्रदर्शित करता है कि नमूने की अखंडता को खोए बिना जटिल ऊतकों की गहरी परतों का अध्ययन करना संभव है। सावधानीपूर्वक काटने की रणनीति और सटीक नेविगेशन को जोड़कर, शोधकर्ताओं ने रेटिना के आंतरिक कामकाज के लिए एक खिड़की खोल दी है जो पहले बंद थी। जबकि उनका वर्तमान ध्यान चूहे की आँख पर था, उनके द्वारा विकसित विधि इस एकल ऊतक तक सीमित नहीं है। पतला करने, मानचित्रण करने और लक्षित काटने के समान सिद्धांतों को मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी जैसे अन्य स्तरित अंगों पर भी लागू किया जा सकता है। उन वैज्ञानिकों के लिए जो प्राकृतिक अवस्था में इन ऊतकों के कार्य करने के आणविक विवरणों को देखने के लिए प्रतीक्षा कर रहे थे, यह नया दृष्टिकोण एक विश्वसनीय मार्ग प्रदान करता है, जो एक कभी असंभव चुनौती को एक नियमित प्रक्रिया में बदल देता है।