Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues

Para ver la maquinaria de la vida en acción, los científicos han dependido durante mucho tiempo de una técnica llamada criotomografía electrónica. Imagine intentar comprender cómo funciona una máquina compleja desmontándola, pero en lugar de desarmarla, la congela instantáneamente para que permanezca exactamente como estaba cuando estaba funcionando. Este método, conocido como criotomografía electrónica, permite a los investigadores tomar fotografías tridimensionales de las células y sus partes internas en un estado casi idéntico al que poseen en la naturaleza. Al congelar las muestras tan rápido que el agua en su interior se convierte en un sólido similar al vidrio en lugar de formar cristales de hielo dañinos, los científicos pueden mirar en el interior sin las distorsiones causadas por los conservantes químicos tradicionales. Sin embargo, esta poderosa herramienta ha chocado con un muro cuando se trata de tejidos gruesos y estratificados como la retina humana. Aunque funciona de maravilla para células individuales y delgadas, tiene dificultades con muestras más gruesas donde el proceso de congelación es desigual y las estructuras objetivo están enterradas demasiado profundo para ser alcanzadas con las herramientas de corte actuales.

Un equipo de investigadores de la Universidad Médica de Wenzhou y de la Academia China de Ciencias ha desarrollado ahora una nueva forma de romper esta barrera. Crearon un método que llaman Criotomografía de Mapeo de Capas Pre-FIB, o PLCT, que actúa como un mapa preciso y una guía quirúrgica combinados. Su objetivo era observar la retina, el tejido sensible a la luz en la parte posterior del ojo, que está organizada en diez capas distintas. Específicamente, querían examinar las sinapsis, las diminutas uniones donde las células nerviosas se comunican entre sí, que se encuentran en lo profundo de la parte media de este tejido. Los intentos previos de congelar y cortar un tejido tan grueso a menudo resultaban en cristales de hielo que destrozaban las delicadas estructuras o perdían la capa objetivo por completo. Los investigadores se dieron cuenta de que, para ver estas capas profundas con claridad, primero tenían que cambiar la forma en que preparaban la muestra, convirtiendo un bloque grueso de tejido en una tira manejable antes de congelarlo.

El proceso comienza con un ojo de ratón. En lugar de intentar congelar la retina completa, que tiene unos 200 micrómetros de espesor, los investigadores la cortaron cuidadosamente en tiras finas, cada una de menos de 100 micrómetros de ancho. Luego, congelaron estas tiras rápidamente mediante congelación a alta presión, una técnica que convierte el agua dentro del tejido en un estado similar al vidrio sin formar cristales de hielo. Este paso fue crucial; los intentos anteriores de congelar la retina completa a la vez fallaron porque los cristales de hielo se formaron en el centro, destruyendo las mismas estructuras que querían estudiar. Una vez congelada, el equipo utilizó un cuchillo especializado para recortar las tiras aún más, eliminando los bordes exteriores para dejar una placa limpia y plana de unos 30 a 50 micrómetros de espesor. Este paso intermedio cerró la brecha entre una pieza gruesa de tejido y la rodaja ultra fina necesaria para la obtención de imágenes de alta resolución.

La verdadera innovación, sin embargo, reside en cómo encontraron el lugar adecuado para mirar. Debido a que la retina está estratificada como un pastel, con diferentes tipos de células nerviosas en cada capa, los investigadores necesitaban saber exactamente dónde estaban cortando. Utilizaron las capas visibles del tejido, como la capa nuclear externa y la capa nuclear interna, como puntos de referencia para navegar. Al medir la posición de estas capas en relación con los bordes de la muestra, pudieron calcular exactamente dónde se encontraba la capa plexiforme externa. Esta capa es donde las células fotorreceptoras se conectan con otras células nerviosas, y se sitúa aproximadamente a 90 o 100 micrómetros de profundidad en el tejido original. Usando este mapa, guiaron un haz de iones focalizado, una herramienta que utiliza un flujo de átomos cargados para tallar el material, para excavar una ventana delgada justo en esa profundidad específica. Esto permitió exponer las sinapsis sin cortar las capas equivocadas o perder el objetivo por completo.

Con la muestra preparada, el equipo utilizó un microscopio electrónico para tomar miles de imágenes desde diferentes ángulos y unirlas en un modelo tridimensional. Lo que encontraron fue una visión clara de la maquinaria celular en su estado natural. Identificaron microtúbulos, que son como el andamiaje interno de la célula, y resolvieron su estructura a un nivel de detalle que mostró 13 hebras dispuestas en círculo. Sorprendentemente, también encontraron un tipo diferente de filamento, que identificaron como neurofilamentos. Estas estructuras aparecieron como haces delgados, similares a cuerdas, con un diámetro de unos 10 nanómetros. Las imágenes revelaron que estos filamentos tenían una forma específica, con seis hebras envolviendo un núcleo central, un patrón que coincide con lo que se sabe sobre los neurofilamentos en otras partes del sistema nervioso. Esta fue la primera vez que estas estructuras se vieron con tal detalle dentro del tejido vivo de la retina.

Los investigadores también observaron las cintas sinápticas, las estructuras especializadas que ayudan a las células nerviosas a liberar señales químicas. En su reconstrucción tridimensional, estas cintas no parecían simples varillas. En su lugar, aparecieron como una serie de pequeñas unidades en forma de bloque apiladas en filas paralelas, asemejándose a un patrón de baldosas. Esta estructura fina, que no se había visto con tal claridad anteriormente, sugiere una forma altamente organizada de empaquetar la maquinaria necesaria para la comunicación rápida entre las células. La capacidad de ver estos detalles confirma que su nuevo método produce muestras de calidad lo suficientemente alta como para revelar la verdadera arquitectura de la célula, libre de las distorsiones del hielo o del tratamiento químico.

Este trabajo demuestra que es posible estudiar las capas profundas de tejidos complejos sin perder la integridad de la muestra. Al combinar una estrategia de corte cuidadosa con una navegación precisa, los investigadores han abierto una ventana a los mecanismos internos de la retina que antes estaba cerrada. Aunque su enfoque actual fue el ojo de ratón, el método que desarrollaron no se limita a este único tejido. Los mismos principios de adelgazamiento, mapeo y corte dirigido podrían aplicarse a otros órganos estratificados, como el cerebro o la médula espinal. Para los científicos que han estado esperando ver los detalles moleculares de cómo funcionan estos tejidos en su estado natural, este nuevo enfoque ofrece un camino fiable, convirtiendo un desafío que antes era imposible en un procedimiento rutinario.