Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues

Per vedere il meccanismo della vita in azione, gli scienziati si sono affidati da tempo a una tecnica chiamata criotomografia elettronica. Immaginate di cercare di capire come funziona una macchina complessa smontandola, ma invece di smontarla, la congelate istantaneamente in modo che rimanga esattamente come era mentre era in funzione. Questo metodo, noto come criotomografia elettronica, consente ai ricercatori di scattare fotografie tridimensionali delle cellule e delle loro parti interne in uno stato quasi identico a quello in cui esistono in natura. Congelando i campioni così rapidamente che l'acqua all'interno si trasforma in un solido simile al vetro anziché formare cristalli di ghiaccio dannosi, gli scienziati possono guardare all'interno senza le distorsioni causate dai tradizionali conservanti chimici. Tuttavia, questo potente strumento si è scontrato con un muro quando si tratta di tessuti spessi e stratificati come la retina umana. Sebbene funzioni magnificamente per cellule singole e sottili, fatica con campioni più spessi dove il processo di congelamento è irregolare e le strutture bersaglio sono troppo profonde per essere raggiunte con gli attuali strumenti di taglio.

Un team di ricercatori della Wenzhou Medical University e della Chinese Academy of Sciences ha ora sviluppato un nuovo modo per superare questa barriera. Hanno creato un metodo che chiamano Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography, o PLCT, che agisce come una combinazione tra una mappa precisa e una guida chirurgica. Il loro obiettivo era osservare la retina, il tessuto fotosensibile nella parte posteriore dell'occhio, che è organizzato in dieci strati distinti. Nello specifico, volevano esaminare le sinapsi, le minuscole giunzioni dove le cellule nervose comunicano tra loro, che si trovano in profondità nel mezzo di questo tessuto. I precedenti tentativi di congelare e tagliare un tessuto così spesso spesso risultavano in cristalli di ghiaccio che frantumavano le delicate strutture o mancavano completamente lo strato bersaglio. I ricercatori si resero conto che, per vedere chiaramente questi strati profondi, dovevano prima cambiare il modo in cui preparavano il campione, trasformando un blocco spesso di tessuto in una striscia gestibile prima del congelamento.

Il processo inizia con un occhio di topo. Invece di cercare di congelare l'intera retina, che è spessa circa 200 micrometri, i ricercatori l'hanno tagliata con cura in sottili strisce, ciascuna larga meno di 100 micrometri. Hanno poi congelato rapidamente queste strisce utilizzando la tecnica del congelamento ad alta pressione, una tecnica che trasforma l'acqua all'interno del tessuto in uno stato simile al vetro senza formare cristalli di ghiaccio. Questo passaggio era cruciale; i precedenti tentativi di congelare l'intera retina in una volta fallivano perché i cristalli di ghiaccio si formavano al centro, distruggendo proprio le strutture che volevano studiare. Una volta congelate, il team ha utilizzato un coltello specializzato per rifilare ulteriormente le strisce, rimuovendo i bordi esterni per lasciare una lastra pulita e piatta di circa 30-50 micrometri di spessore. Questo passaggio intermedio ha colmato il divario tra un pezzo di tessuto spesso e la fetta ultra-sottile necessaria per l'imaging ad alta risoluzione.

La vera innovazione, tuttavia, risiede nel modo in cui hanno trovato il punto giusto in cui guardare. Poiché la retina è stratificata come una torta, con diversi tipi di cellule nervose in ogni strato, i ricercatori avevano bisogno di sapere esattamente dove stavano tagliando. Hanno utilizzato gli strati visibili del tessuto, come lo strato nucleare esterno e lo strato nucleare interno, come punti di riferimento per navigare. Misurando la posizione di questi strati rispetto ai bordi del campione, potevano calcolare esattamente dove si trocasse lo strato plessiforme esterno. Questo strato è dove le cellule fotorecettrici si connettono con altre cellule nervose, e si trova a circa 90-100 micrometri di profondità nel tessuto originale. Usando questa mappa, hanno guidato un fascio ionico focalizzato, uno strumento che utilizza un flusso di atomi carichi per scavare via il materiale, per scavare una sottile finestra proprio a quella specifica profondità. Ciò ha permesso loro di esporre le sinapsi senza tagliare gli strati sbagliati o mancare completamente l'obiettivo.

Una volta preparato il campione, il team ha utilizzato un microscopio elettronico per scattare migliaia di immagini da diverse angolazioni e assemblarle in un modello tridimensionale. Ciò che hanno trovato è stata una visione chiara del meccanismo cellulare nel suo stato naturale. Hanno identificato i microtubuli, che sono come l'impalcatura interna della cellula, e ne hanno risolto la struttura a un livello di dettaglio che mostrava 13 filamenti disposti in cerchio. Più sorprendentemente, hanno anche trovato un tipo diverso di filamento, che hanno identificato come neurofilamenti. Queste strutture apparivano come fasci sottili, simili a corde, con un diametro di circa 10 nanometri. Le immagini hanno rivelato che questi filamenti avevano una forma specifica, con sei filamenti che avvolgevano un nucleo centrale, un modello che corrisponde a quanto noto sui neurofilamenti in altre parti del sistema nervoso. Questa è stata la prima volta che queste strutture sono state viste con tale dettaglio all'interno del tessuto vivente della retina.

I ricercatori hanno anche esaminato le sinapsi a nastro, le strutture specializzate che aiutano le cellule nervose a rilasciare segnali chimici. Nella loro ricostruzione tridimensionale, queste nastro non apparivano come semplici bastoncini. Invece, apparivano come una serie di piccole unità simili a blocchi impilate in file parallele, ricordando un motivo a piastrelle. Questa struttura fine, che non era mai stata vista con tale chiarezza prima d'ora, suggerisce un modo altamente organizzato di impacchettare il macchinario necessario per una comunicazione rapida tra le cellule. La capacità di vedere questi dettagli conferma che il loro nuovo metodo produce campioni di qualità sufficientemente alta da rivelare la vera architettura della cellula, libera dalle distorsioni del ghiaccio o del trattamento chimico.

Questo lavoro dimostra che è possibile studiare gli strati profondi di tessuti complessi senza perdere l'integrità del campione. Combinando una strategia di taglio accurata con una navigazione precisa, i ricercatori hanno aperto una finestra sul funzionamento interno della retina che era precedentemente chiusa. Sebbene il loro attuale focus fosse sull'occhio del topo, il metodo che hanno sviluppato non è limitato a questo singolo tessuto. Gli stessi principi di assottigliamento, mappatura e taglio mirato potrebbero essere applicati ad altri organi stratificati, come il cervello o il midollo spinale. Per gli scienziati che hanno aspettato di vedere i dettagli molecolari di come questi tessuti funzionano nel loro stato naturale, questo nuovo approccio offre una strada affidabile, trasformando una sfida un tempo impossibile in una procedura di routine.