Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues

Om de machinerie van het leven in actie te zien, hebben wetenschappers lang vertrouwd op een techniek genaamd cryo-elektrontomografie. Stel je voor dat je probeert te begrijpen hoe een complexe machine werkt door hem uit elkaar te halen, maar in plaats van hem te demonteren, bevries je hem onmiddellijk zodat hij precies blijft zoals hij was toen hij nog draaide. Deze methode, bekend als cryo-elektrontomografie, stelt onderzoekers in staat om driedimensionale foto's te maken van cellen en hun interne onderdelen in een staat die bijna identiek is aan hoe ze in de natuur bestaan. Door monsters zo snel te bevriezen dat het water erin verandert in een glasachtige vaste stof in plaats van het vormen van schadelijke ijskristallen, kunnen wetenschappers naar binnen kijken zonder de vervormingen die door traditionele chemische conserveringsmiddelen worden veroorzaakt. Deze krachtige tool liep echter tegen een muur op wanneer het gaat om dikke, gelaagde weefsels zoals het menselijk netvlies. Hoewel het prachtig werkt voor dunne, enkelvoudige cellen, heeft het moeite met dikkere monsters waarbij het bevriezingsproces ongelijkmatig is en de doelstructuren te diep begraven liggen om bereikt te worden met huidige snijgereedschappen.

Een team van onderzoekers aan de Wenzhou Medical University en de Chinese Academy of Sciences heeft nu een nieuwe manier ontwikkeld om deze barrière te doorbreken. Ze creëerden een methode die ze Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography, of PLCT, noemen, wat werkt als een combinatie van een nauwkeurige kaart en een chirurgische gids. Hun doel was om naar het netvlies te kijken, het lichtgevoelige weefsel aan de achterkant van het oog, dat is georganiseerd in tien duidelijke lagen. Specifiek wilden ze de synapsen onderzoeken, de kleine verbindingen waar zenuwcellen met elkaar communiceren, die zich diep in het midden van dit weefsel bevinden. Eerdere pogingen om dergelijk dik weefsel te bevriezen en te snijden, resulteerden vaak in ijskristallen die de delicate structuren verbrijzelden of de doelgelaagdheid volledig misten. De onderzoekers realiseerden zich dat om deze diepe lagen duidelijk te kunnen zien, ze eerst de manier waarop ze het monster voorbereidden moesten veranderen, door een dik blok weefsel in een hanteerbare strook te veranderen voordat ze het bevroren.

Het proces begint met een muis-oog. In plaats van te proberen het hele netvlies te bevriezen, dat ongeveer 200 micrometer dik is, hebben de onderzoekers het voorzichtig in dunne stroken gesneden, elk minder dan 100 micrometer breed. Vervolgens hebben ze deze stroken razendsnel bevroren met high-pressure freezing, een techniek die het water in het weefsel in een glasachtige staat verandert zonder ijskristallen te vormen. Deze stap was cruciaal; eerdere pogingen om het hele netvlies in één keer te bevriezen faalden omdat de ijskristallen in het centrum ontstonden, waardoor de structuren die ze wilden bestuderen werden vernietigd. Nadat het was bevroren, gebruikte het team een gespecialiseerd mes om de stroken verder bij te snijden, waarbij de buitenranden werden verwijderd om een schoon, plat blok van ongeveer 30 tot 50 micrometer dik over te laten. Deze tussenstap overbrugde de kloof tussen een dik stuk weefsel en de ultra-dunne doorsnede die nodig is voor hoogresolutie-imaging.

De echte innovatie ligt echter in de manier waarop ze de juiste plek vonden om te kijken. Omdat het netvlies gelaagd is als een taart, met verschillende soorten zenuwcellen in elke laag, moesten de onderzoekers precies weten waar ze sneden. Ze gebruikten de zichtbare lagen van het weefsel, zoals de buitenste nucleaire laag en de binnenste nucleaire laag, als oriëntatiepunten om te navigeren. Door de positie van deze lagen te meten ten opzichte van de randen van het monster, konden ze exact berekenen waar de buitenste plexiforme laag zich bevond. Dit is de laag waar de fotoreceptoren zich verbinden met andere zenuwcellen, en deze bevindt zich op ongeveer 90 tot 100 micrometer diepte in het oorspronkelijke weefsel. Met behulp van deze kaart stuurden ze een gefocuste ionenstraal, een instrument dat een stroom geladen atomen gebruikt om materiaal weg te slijpen, om een dun venster te creëren op precies die diepte. Dit stelde hen in staat om de synapsen bloot te leggen zonder door de verkeerde lagen te snijden of het doel volledig te missen.

Met het monster voorbereid, gebruikte het team een elektronenmicroscoop om duizenden afbeeldingen vanuit verschillende hoeken te maken en deze samen te voegen tot een driedimensionaal model. Wat ze vonden, was een helder beeld van de cellulaire machinerie in zijn natuurlijke staat. Ze identificeerden microtubuli, die fungeren als de interne steigers van de cel, en losten hun structuur op tot een niveau van detail dat 13 strengen in een cirkel liet zien. Nog verrassender was dat ze ook een ander type filament vonden, dat zij identificeerden als neurofilamenten. Deze structuren verschenen als dunne, touwachtige bundels met een diameter van ongeveer 10 nanometer. De afbeeldingen toonden aan dat deze filamenten een specifieke vorm hadden, met zes strengen die rond een centrale kern gewikkeld waren, een patroon dat overeenkomt met wat bekend is over neurofilamenten in andere delen van het zenuwstelsel. Dit was de eerste keer dat deze structuren in dergelijk detail waren waargenomen binnen het levende weefsel van het netvlies.

De onderzoekers keken ook naar de synaptische linten (synaptic ribbons), de gespecialiseerde structuren die zenuwcellen helpen bij het vrijgeven van chemische signalen. In hun driedimensionale reconstructie zagen deze linten er niet uit als eenvoudige staven. In plaats daarvan verschenen ze als een reeks kleine, blokvormige eenheden die parallel aan elkaar gestapeld waren, wat leek op een patroon van tegels. Deze fijne structuur, die nog nooit met een dergelijke helderheid was gezien, suggereert een hoogst georganiseerde manier van het verpakken van de machinerie die nodig is voor snelle communicatie tussen cellen. Het vermogen om deze details te zien, bevestigt dat hun nieuwe methode monsters van een kwaliteit produceert die hoog genoeg is om de ware architectuur van de cel te onthullen, vrij van de vervormingen door ijs of chemische behandeling.

Dit werk demonstreert dat het mogelijk is om de diepe lagen van complexe weefsels te bestuderen zonder de integriteit van het monster te verliezen. Door een zorgvuldige snijstrategie te combineren met precieze navigatie, hebben de onderzoekers een venster geopend naar de innerlijke werking van het netvlies dat voorheen gesloten was. Hoewel hun huidige focus op het oog van een muis lag, is de methode die zij hebben ontwikkeld niet beperkt tot dit enkele weefsel. Dezelfde principes van verdunning, mapping en gerichte snijtechnieken kunnen worden toegepast op andere gelaagde organen, zoals de hersenen of het ruggenmerg. Voor wetenschappers die hebben gewacht om de moleculaire details van hoe deze weefsels functioneren in hun natuurlijke staat te zien, biedt deze nieuwe benadering een betrouwbaar pad voorwaarts, waarbij een eens onmogelijke uitdaging wordt omgezet in een routineprocedure.