Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues
作者开发了前置聚焦离子束层映射冷冻断层扫描技术（Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography, PLCT），这是一种结合了改良高压冷冻和等离子体聚焦离子束切割的集成工作流，旨在实现对视网膜等多层组织的高分辨率、深度解析冷冻电子断层扫描，并成功揭示了诸如神经丝和突触小体等原生超微结构。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
为了观察生命机制的运作，科学家们长期以来一直依赖一种被称为冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography）的技术。想象一下，试图通过拆解一台复杂的机器来理解它的工作原理，但你不是将其拆解，而是瞬间将其冻结，使其保持运行时的原样。这种被称为冷冻电子断层扫描的方法，让研究人员能够拍摄细胞及其内部结构的三维图像，其状态几乎与它们在自然界中的存在状态完全一致。通过将样本极速冷冻，使其中的水分转化为玻璃状固体而非形成具有破坏性的冰晶，科学家们可以在没有传统化学防腐剂造成的畸变的情况下，窥探其内部结构。然而，当面对像人类视网膜这样厚且具有分层结构的组织时，这一强大的工具遇到了瓶颈。虽然它在处理薄的单细胞时表现出色，但在处理较厚的样本时却显得力不从心，因为在这些样本中，冷冻过程分布不均，且目标结构埋得太深，现有的切割工具无法触及。
来自温州医科大学和中国科学院的研究团队现在开发出了一种突破这一障碍的新方法。他们创造了一种被称为前聚焦离子束层映射冷冻断层扫描（Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography，简称 PLCT）的方法，该方法就像是一个精确的地图与手术指南的结合体。他们的目标是观察视网膜——即眼睛后方感光组织——其内部结构，该组织由十个不同的层组成。具体而言，他们想要检查突触，即神经细胞相互交流的微小连接点，这些连接点位于该组织的深处中间位置。以往尝试冷冻和切割此类厚组织的方法，往往会导致冰晶破碎脆弱的结构，或者完全错过目标层。研究人员意识到，要清晰地观察这些深层结构，他们首先必须改变样本制备方式，在冷冻之前将厚重的组织块转化为易于处理的条状物。
该过程始于一只小鼠的眼睛。研究人员并没有尝试冷冻整个视网膜（其厚度约为 200 微米），而是小心地将其切割成宽度小于 100 微米的薄条。然后，他们使用高压冷冻技术对这些条状物进行闪冻，这种技术能将组织内的水分转化为玻璃状状态，而不形成冰晶。这一步至关重要；此前尝试一次性冷冻整个视网膜的尝试都失败了，因为中心位置会形成冰晶，从而破坏了他们想要研究的结构。冻结完成后，团队使用一种专门的刀具进一步修剪这些条状物，去除外缘，从而留下一个约 30 到 50 微米厚的平整薄板。这一中间步骤填补了厚组织块与高分辨率成像所需的超薄切片之间的空白。
然而，真正的创新在于他们如何找到正确的观察位置。由于视网膜像蛋糕一样具有层次感，每一层都有不同类型的神经细胞，因此研究人员需要准确知道自己在哪里进行切割。他们利用组织中可见的各层（如外核层和内核层）作为导航的地标。通过测量这些层相对于样本边缘的位置，他们可以精确计算出外丛状层的位置。这一层是光感受器细胞与其他神经细胞连接的地方，位于原始组织约 90 到 100 微米深处。利用这张“地图”，他们引导聚焦离子束（一种利用带电原子流来雕刻材料的工具）在特定的深度处铣出一个薄窗口。这使得他们能够在不切穿错误层或完全错过目标的情况下，暴露突触。
样本准备就绪后，团队使用电子显微镜从不同角度拍摄数千张图像，并将它们拼接成一个三维模型。他们发现了一个清晰的视角，可以观察到处于自然状态下的细胞机制。他们识别出了微管（类似于细胞的内部支架），并解析了其结构，显示出由 13 根细丝排列成的圆环。更令人惊讶的是，他们还发现了另一种类型的丝状结构，并将其鉴定为神经丝。这些结构呈现为直径约为 10 纳米的细长绳索状束。图像显示，这些丝状物具有特定的形状，即六根细丝围绕着一个中心核旋转，这一模式与已知在神经系统其他部分存在的神经丝相吻合。这是首次如此详细地在视网膜的活体组织中观察到这些结构。
研究人员还观察了突触小体，即帮助神经细胞释放化学信号的专门结构。在他们的三维重建中，这些小体看起来并不像简单的杆状物。相反，它们看起来像是许多小块状单元以平行行的方式堆叠在一起，呈现出类似瓷砖铺设的模式。这种精细的结构此前从未被如此清晰地观察到，它表明细胞间快速通信所需的机制具有高度有序的包装方式。能够观察到这些细节，证实了他们的新方法所产生的样本具有足够高的质量，能够揭示真实的细胞架构，且不受冰晶或化学处理的干扰。
这项工作证明，研究复杂组织的深层结构而不会破坏样本完整性是可能的。通过将精细的切割策略与精确的导航相结合，研究人员打开了一扇通往视网膜内部运作机制的窗口，而这扇窗户此前一直是关闭的。虽然他们目前的研究重点是小鼠眼睛，但他们开发出的这种方法并不局限于这一种组织。这种结合了减薄、制图和定向切割的原则同样可以应用于其他分层器官，如大脑或脊髓。对于那些一直渴望在自然状态下观察这些组织功能分子细节的科学家来说，这种新方法提供了一条可靠的路径，将曾经不可能完成的挑战变成了常规程序。
您所在领域的论文太多了？
获取与您研究关键词匹配的最新论文每日摘要——附技术摘要，使用您的语言。