Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography (PLCT) for Depth-Resolved in Situ Structural Analysis of Multilayered Tissues

생명의 기계 장치가 작동하는 모습을 보기 위해, 과학자들은 오랫동안 저온 전자 단층 촬영(cryo-electron tomography)이라 불리는 기술에 의존해 왔습니다. 복잡한 기계가 어떻게 작동하는지 이해하기 위해 그것을 분해하려고 노력한다고 상상해 보십시오. 하지만 분해하는 대신, 기계가 작동 중일 때의 상태 그대로 유지되도록 즉각적으로 얼려버리는 것입니다. 저온 전자 단층 촬영으로 알려진 이 방법은 연구자들이 세포와 그 내부 구조를 자연 상태와 거의 동일한 상태에서 3차원 사진으로 찍을 수 있게 해줍니다. 샘플 내부의 물이 손상을 주는 얼음 결정이 되는 대신 유리 같은 고체로 변할 만큼 빠르게 샘플을 얼림으로써, 과학자들은 전통적인 화학 보존제에 의한 왜곡 없이 내부를 들여다볼 수 있습니다. 그러나 이 강력한 도구는 인간의 망막과 같이 두껍고 층이 있는 조직에 있어서는 한계에 부딪혔습니다. 이 방법은 얇은 단일 세포에는 훌륭하게 작동하지만, 냉동 과정이 불균일하고 현재의 절단 도구로는 도달하기에는 목표 구조가 너무 깊이 묻혀 있는 두꺼운 샘플에는 어려움을 겪습니다.

원저우 의과대학교와 중국 과학원의 연구팀은 이제 이 장벽을 허물 수 있는 새로운 방법을 개발했습니다. 그들은 PLCT(Pre-FIB Layer-Mapping Cryo Tomography)라고 부르는 방법을 만들었는데, 이는 정밀한 지도와 수술 가이드가 결합된 것과 같습니다. 그들의 목표는 눈 뒷부분의 빛을 감지하는 조직인 망막을 관찰하는 것이었으며, 망막은 10개의 뚜렷한 층으로 구성되어 있습니다. 구체적으로, 그들은 이 조직의 중간 깊은 곳에 위치한 신경 세포들이 서로 신호를 주고받는 작은 접점인 시냅스를 조사하고자 했습니다. 이처럼 두꺼운 조직을 얼리고 자르려는 이전의 시도들은 종종 섬세한 구조를 파괴하는 얼음 결정을 만들거나 목표 층을 완전히 놓치곤 했습니다. 연구진은 이러한 깊은 층을 명확하게 보기 위해서는 먼저 샘플 준비 방식을 바꾸어, 두꺼운 조직 블록을 얼리기 전 관리 가능한 형태의 띠로 만들어야 한다는 것을 깨달았습니다.

과정은 생쥐의 눈에서 시작됩니다. 약 200마이크로미터 두께인 망막 전체를 얼리려고 시도하는 대신, 연구진은 이를 각각 100마이크로미터 미만 너비의 얇은 띠로 정교하게 잘랐습니다. 그런 다음 고압 냉동 기술을 사용하여 이 띠들을 급속 냉동했는데, 이 기술은 조직 내부의 물을 얼음 결정 형성 없이 유리 같은 상태로 변화시킵니다. 이 단계는 매우 중요했습니다. 망막 전체를 한꺼번에 얼리려던 이전의 시도들은 중심부에 얼음 결정이 형성되어 연구하고자 했던 바로 그 구조들을 파괴했기 때문입니다. 냉동이 완료되면, 팀은 특수 칼을 사용하여 띠를 더 얇게 다듬고 가장자리를 제거하여 약 30~50마이크로미터 두께의 깨끗하고 평평한 판을 남겼습니다. 이 중간 단계는 두꺼운 조직 조각과 고해상도 이미징에 필요한 초박형 절편 사이의 간극을 메워주었습니다.

그러나 진정한 혁신은 그들이 적절한 지점을 찾아내는 방식에 있습니다. 망 \text{막은 각 층마다 다른 유형의 신경 세포가 있는 케이크처럼 층이 나누어져 있기 때문에}, 연구진은 자신이 어디를 자르고 있는지 정확히 알 필요가 있었습니다. 그들은 외핵층(outer nuclear layer)이나 내핵층(inner nuclear layer)과 같은 가시적인 조직 층을 이정표로 삼아 탐색했습니다. 샘플의 가장자리와 비교하여 이 층들의 위치를 측정함으로써, 그들은 외망상층(outer plexiform layer)이 정확히 어디에 위치하는지 계산할 수 있었습니다. 이 층은 광수용기 세포가 다른 신경 세포와 연결되는 곳이며, 원래 조직으로부터 약 90~100마이크로미터 깊이에 위치합니다. 이 지도를 사용하여, 그들은 충전된 원자 흐름을 이용해 재료를 깎아내는 도구인 집속 이온 빔(focused ion beam)을 유도하여 해당 특정 깊이에 얇은 창을 냈습니다. 이를 통해 잘못된 층을 자르거나 목표를 완전히 놓치지 않고 시냅스를 노출할 수 있었습니다.

샘플 준비가 끝나자, 팀은 전자 현미경을 사용하여 다양한 각도에서 수천 장의 이미지를 찍고 이를 하나로 합쳐 3차원 모델을 만들었습니다. 그들이 발견한 것은 자연스러운 상태에서의 세포 기계 장치에 대한 선명한 모습이었습니다. 그들은 세포의 내부 골격과 같은 미세소관(microtubules)을 식별하였고, 13개의 가닥이 원형으로 배열된 구조를 보여줄 정도로 세밀하게 구조를 규명했습니다. 더욱 놀랍게도, 그들은 또 다른 유형의 필라멘트를 발견하였으며 이를 신경 필라멘트(neurofilaments)라고 식별했습니다. 이 구조체들은 약 10나노미터 직경의 가늘고 밧줄 같은 다발 형태로 나타났습니다. 이미지는 이 필라멘트들이 중심 핵을 감싸는 6개의 가닥을 가진 특정 형태를 가지고 있음을 보여주었으며, 이는 신경계의 다른 부분에서 알려진 신경 필라멘트의 패턴과 일치했습니다. 이는 이러한 구조체가 망막의 살아있는 조직 내에서 이토록 상세하게 관찰된 첫 사례였습니다.

연구진은 또한 신경 세포가 화학적 신호를 방출하는 데 도움을 주는 특수 구조인 시냅스 리본(synaptic ribbons)도 살펴보았습니다. 3차원 재구성 결과, 이 리본들은 단순한 막대 모양이 아니었습니다. 대신, 그것들은 평행한 열을 따라 쌓여 있는 일련의 작은 블록 형태 단위들처럼 보였으며, 마치 타일을 배치한 듯한 패턴을 띠고 있었습니다. 이 미세한 구조는 이전에는 이토록 명확하게 본 적이 없었던 것으로, 세포 간의 빠른 통신에 필요한 기계 장치들이 매우 조직적인 방식으로 패킹되어 있음을 시사합니다. 이러한 세부 사항을 관찰할 수 있는 능력은 그들의 새로운 방법이 얼음이나 화학적 처리에 의한 왜곡 없이 세포의 진정한 구조를 드러낼 수 있을 만큼 높은 품질의 샘 샘플을 생성한다는 것을 입증합니다.

이 연구는 샘플의 무결성을 잃지 않고도 복잡한 조직의 깊은 층을 연구하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다. 정교한 절단 전략과 정밀한 탐색을 결합함으로써, 연구진은 이전에 닫혀 있었던 망막의 내부 작동 원리를 들여다볼 수 있는 창을 열었습니다. 현재 그들의 초점은 생쥐의 눈에 맞춰져 있지만, 그들이 개발한 방법은 이 단일 조직에 국한되지 않습니다. 얇게 만들기, 매핑하기, 그리고 표적 절단이라는 동일한 원칙은 뇌나 척수와 같은 다른 층 구조를 가진 장기에도 적용될 수 있습니다. 이 조직들이 자연 상태에서 어떻게 기능하는지에 대한 분자적 세부 사항을 보고 싶어 했던 과학자들에게, 이 새로운 접근법은 한때 불가능했던 과제를 일상적인 절차로 바꾸어 놓는 신뢰할 수 있는 길을 제시합니다.