Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
تقدم هذه الدراسة سير عمل LiFEx الذي يربط بين تصوير الخلايا الحية ومجهر التوسع المُعدل للتغلب على قيود التوسع البكتيري والكشف عن التفاعلات الديناميكية بين المضيف والممرض، وتحديداً من خلال ربط تجميع T6SS-5 بالتغيرات الغشائية السريعة أثناء عدوى بكتيريا Burkholderia thailandensis.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
لرؤية الآليات غير المرئية للحياة، يضطر العلماء غالباً إلى تقليص أدواتهم أو بنائها من الصفر. لعقود من الزمن، كان الحد الأقصى لما يمكن للمجهر الضوئي إظهاره محدداً بفيزياء الضوء نفسها؛ إذ كانت الهياكل الدقيقة الأصغر من نصف الطول الموجي للضوء تتداخل وتندمج معاً، مما يخفي التفاصيل المعقدة للخلايا والبكتيريا التي تعيش داخلها. ظهرت "مجهرية التمدد" (Expansion microscopy) كحل ذكي لهذه المشكلة. فبدلاً من بناء عدسة أكثر قوة، وجد الباحثون طريقة لتمديد العينة نفسها فيزيائياً. ومن خلال دمج العينة في هلام خاص ينتفخ عند نقع في الماء، يمكنهم سحب الهياكل البيولوجية بعيداً عن بعضها البعض، مما يجعلها أكبر وأسهل في الرؤية باستخدام المجاهر القياسية. لقد أحدثت هذه التقنية ثورة في كيفية رؤيتنا لبنية الخلايا، لكنها اصطدمت بحائط مسدود عند تطبيقها على البكتيريا. فهذه الغزاة المجهرية مغلفة بغلاف واقٍ صلب يقاوم التمدد، مما يؤدي غالباً إلى بقائها صغيرة ومشوهة بينما تنتفخ الخلية المضيفة المحيطة بها. إن فهم كيفية تحرك البكتيريا وانتشارها بين الخلايا البشرية يتطلب رؤية هذه الهياكل الصغيرة بوضوح، ومع ذلك فإن الدرع ذاته الذي يحمي البكتيريا هو الذي يحجبها عن الرؤية.
قام فريق من الباحثين في جامعة بازل الآن بتكييف تقنية التمدد هذه للنظر داخل الخلايا البشرية المصابة ببكتيريا Burkholderia thailandensis، وهي بكتيريا تعمل كنموذج لممرض أكثر خطورة. أرادوا فهم كيفية انتقال هذه البكتيريا من خلية إلى أخرى، وهي عملية تتضمن الدفع ضد غشاء الخلية لتشكيل جسر نحو خلية مجاورة. كان التحدي يكمن في أنه بينما تمددت الخلايا البشرية في تجاربهم بمقدار تسعة أضعاف حجمها الأصلي تقريباً، رفضت البكتيريا بداخلها التمدد بنفس القدر، وظلت منكمشة وغير متساوية. شرع الباحثون في معرفة سبب مقاومة البكتيريا للتمدد، وفي تطوير طريقة لربط ما رأوه في العينات الممددة والمجمدة بالأحداث الحية والمتحركة التي حدثت قبل لحظات فقط.
تناول الفريق أولاً مسألة ما الذي كان يعيق البكتيريا. اشتبهوا في أن جدار الخلية البكتيرية، وهو شبكة صلبة من السكر والبروتين تعمل كدرع، قد يكون هو الجاني. في تجاربهم، حاولوا إزالة هذا الجدار باستخدام الإنزيمات قبل تمديد العينة. ومن المثير للدهشة أن إزالة الجدار لم تجعل البكتيريا تتمدد بالكامل؛ بل ظلت أصغر من الخلايا البشرية المحيطة بها. كما اختبروا ما إذا كان الغشاء الخارجي للبكتيريا شديد الإحكام أو ما إذا كانت البروتينات بداخلها متراصة بشدة بحيث لا تسمح بالتمدد. وحتى عندما استخدموا إنزيمات أقوى لهضم البروتينات أو مواد كيميائية لإرخاء الغشاء الخاري، لم تتمدد البكتيريا بشكل منتظم. العامل الوحيد الذي بدا أنه أحدث فرقاً كبيراً هو كيفية حفظ الخلايا قبل بدء التجربة. وجد الباحثون أن الخليط المحدد من المواد الكيميائية المستخدمة لتثبيت الخلايا — أي لتجميدها في مكانها — هو الذي يحدد ما إذا كانت البكتيريا ستتمدد بشكل متساوٍ أم ستظل مشوهة. يشير هذا الاكتشاف إلى أن الطريقة التي يجهز بها العلماء عيناتهم لا تقل أهمية عن عملية التمدد نفسها.
على الرغم من أن البكتيريا لم تتمدد بشكل مثالي، إلا أن الطريقة الجديدة سمحت للفريق برؤية تفاصيل من العدوى كان من المستحيل حلها سابقاً. لاحظوا البكتيريا وهي تدفع غشاء الخلية البشرية لإنشاء نتوءات طويلة ونحيفة تصل إلى الخلايا المجاورة. في بعض الحالات، كانت هذه النتوءات ملساء ومستمرة، ولكن في حالات أخرى، بدا الغشاء مكسوراً أو مجزأً. استطاع الباحثون رؤية أن البكتيريا تستخدم آلة جزيئية متخصصة، تُعرف باسم نظام الإفراز، لثقب هذه الأغشية والهروب إلى الخلية التالية. ومع ذلك، ولأن الطريقة القياسية لا تظهر سوى لقطة ثابتة بعد تثبيت العينة، لم يتمكنوا من تحديد متى انكسر الغشاء بالضبط بالنسبة للحظة إطلاق البكتيريا لآلتها الجزيئية.
ولحل هذه المشكلة، طور الفريق سير عمل جديد أطلقوا عليه اسم LiFEx، وهو اختصار لـ "مجهرية التمدد من الحالة الحية إلى الحالة المثبتة" (Live-to-Fixed Expansion microscopy). سمح هذا النهج للفريق بمراقبة حركة البكتيريا في الوقت الفعلي، وتسجيل اللحظة الدقيقة لوقوع حدث معين، ثم تثبيت العينة فوراً في مكانها دون تحريكها. بعد ذلك، تمكنوا من معالجة تلك المنطقة الصغيرة نفسها عبر بروتوكول التمدد الخاص بهم والنظر إليها مرة أخرى تحت مجهر عالي القوة. ومن خلال مقارنة الفيديو الحي بالصورة الممددة عالية الدقة، تمكنوا من قياس التأخير الزمني بين تجميع البكتيريا لسلاحها الجزيئي وبين التمزق الفعلي للغشاء الخلوي. ووجدوا أن الغشاء لم ينكسر فوراً؛ بل استغرق الأمر عدة دقائق حتى يصبح الضرر الهيكلي مرئياً بعد أن أطلقت البكتيريا نظامها.
يوفر هذا العمل صورة أوضح لكيفية تنقل الممرضات داخل الخلايا. أظهر الباحثون أنه بينما يعد جدار الخلية البكتيرية عاملاً مؤثراً، فإنه ليس العائق الوحيد أمام رؤية هذه الهياكل الصغيرة بوضوح، وأن الظروف الكيميائية المستخدمة لحفظ العينة تلعب دوراً رئيسياً في جودة الصورة النهائية. والأهم من ذلك، أنه من خلال الجمع بين المراقبة الحية والتحليل الهيكلي عالي الدقة، كشفوا عن التوقيت الدقيق لكيفية اختراق هذه البكتيريا لدفاعات خلاياها المضيفة. لا يدعي البحث أنه قد حل مشكلة تمدد البكتيريا تماماً، حيث لا تزال البكتيريا لا تتمدد بقدر الخلايا البشرية، ولكنه يقدم طريقة قوية لدراسة التفاعلات الديناميكية بين الممرضات ومضيفيها بمستوى من التفصيل كان بعيد المنال في السابق.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.