Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
Diese Studie führt einen LiFEx-Workflow ein, der Live-Cell-Imaging mit adaptierter Expansionsmikroskopie korreliert, um die Einschränkungen der bakteriellen Expansion zu überwinden und dynamische Wirt-Pathogen-Interaktionen aufzuklären, indem spezifisch die T6SS-5-Assemblierung mit schnellen Membranveränderungen während einer *Burkholderia thailandensis*-Infektion verknüpft wird.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
Um die unsichtbare Maschinerie des Lebens zu sehen, müssen Wissenschaftler ihre Werkzeuge oft verkleinern oder sie von Grund auf neu erschaffen. Jahrzehntelang wurde das Limit dessen, was ein Lichtmikroskop zeigen konnte, durch die Physik des Lichts selbst bestimmt; winzige Strukturen, die kleiner als die halbe Wellenlänge des Lichts sind, verschwammen ineinander und verbargen die komplizierten Details der Zellen und der Bakterien, die in ihnen leben. Die Expansionsmikroskopie entstand als eine clevere Umgehung dieses Problems. Anstatt eine leistungsstärkere Linse zu bauen, fanden Forscher einen Weg, die Probe selbst physisch zu dehnen. Indem sie eine Probe in ein spezielles Gel einbetten, das sich beim Aufsaugen von Wasser aufquillt, können sie die biologischen Strukturen auseinanderziehen, wodurch sie größer und mit Standardmikroskopen leichter sichtbar werden. Diese Technik hat die Art und Weise, wie wir die Architektur von Zellen betrachten, revolutioniert, stieß jedoch an eine Grenze, als sie auf Bakterien angewendet wurde. Diese mikroskopisch kleinen Invasoren sind in eine zähe, schützende Hülle gehüllt, die dem Dehnen widersteht, was oft dazu führt, dass sie klein und verzerrt bleiben, während die umgebende Wirtszelle anschwillt. Das Verständnis darüber, wie sich Bakterien bewegen und zwischen menschlichen Zellen ausbreiten, erfordert ein klares Sehen dieser winzigen Strukturen, doch eben jene Rüstung, die die Bakterien schützt, verbirgt sie auch vor dem Blick.
Ein Team von Forschern an der Universität Basel hat nun diese Dehnungstechnik angepasst, um in menschliche Zellen zu blicken, die mit Burkholderia thailandensis infiziert sind – einem Bakterium, das als Modell für einen gefährlicheren Erreger dient. Sie wollten verstehen, wie sich diese Bakterien von einer Zelle zur anderen bewegen, ein Prozess, der beinhaltet, gegen die Zellmembran zu drücken, um eine Brücke zu einem Nachbarn zu bilden. Die Herausforderung bestand darin, dass die menschlichen Zellen in ihren Experimenten fast neunmal ihre ursprüngliche Größe erreichten, während die Bakterien in ihnen sich weigerten, sich so stark zu dehnen, und stattdessen geschrumpft und ungleichmäßig blieben. Die Forscher gingen der Frage nach, warum die Bakterien der Expansion widerstanden, und entwickelten einen Weg, um das, was sie in den gedehnten, eingefrorenen Proben sahen, mit den lebenden, beweglichen Ereignissen zu verknüpfen, die kurz zuvor stattgefunden hatten.
Das Team widmete sich zuerst der Frage, was die Bakterien zurückhielt. Sie vermuteten, dass die bakterielle Zellwand, ein starres Geflecht aus Zucker und Proteinen, das als Schild fungiert, der Übeltäter sein könnte. In ihren Experimenten versuchten sie, diese Wand vor dem Dehnen der Probe mithilfe von Enzymen zu entfernen. Überraschenderweise führte das Entfernen der Wand nicht dazu, dass die Bakterien sich vollständig ausdehnten; sie blieben immer noch kleiner als die umgebenden menschlichen Zellen. Sie testeten auch, ob die äußere Membran der Bakterien zu fest war oder ob die Proteine im Inneren zu dicht gepackt waren, um eine Dehnung zu ermöglichen. Selbst als sie stärkere Enzyme zur Verdauung der Proteine oder Chemikalien zur Lockerung der äußeren Membran einsetzten, dehnten sich die Bakterien immer noch nicht gleichmäßig aus. Der einzige Faktor, der einen signifikanten Unterschied zu machen schien, war die Art und Weise, wie die Zellen vor dem Experiment konserviert wurden. Die Forscher fanden heraus, dass die spezifische Mischung der Chemikalien, die zur Fixierung der Zellen verwendet wurde – im Wesentlichen, um sie an Ort und Stelle einzufrieren – entscheidend dafür war, ob sich die Bakterien gleichmäßig dehnten oder verzerrt blieben. Diese Entdeckung legt nahe, dass die Art und Weise, wie Wissenschaftler ihre Proben vorbereiten, genauso kritisch ist wie der Dehnungsprozess selbst.
Trotz der Tatsache, dass sich die Bakterien nicht perfekt dehnten, ermöglichte die neue Methode dem Team, Details der Infektion zu sehen, die zuvor unmöglich aufzulösen waren. Sie beobachteten, wie die Bakterien gegen die menschliche Zellmembran drückten, um lange, dünne Fortsätze zu erzeugen, die in benachbarte Zellen reichen. In einigen Fällen waren diese Fortsätze glatt und kontinuierlich, in anderen Fällen erschien die Membran jedoch gebrochen oder fragmentiert. Die Forscher konnten beobachten, dass die Bakterien eine spezialisierte molekulare Maschine, bekannt als Sekretionssystem, verwendeten, um Löcher in diese Membranen zu schlagen und in die nächste Zelle zu entkommen. Da die Standardmethode jedoch nur eine statische Momentaufnahme nach der Fixierung der Probe zeigt, konnten sie nicht genau feststellen, wann die Membran im Verhältnis zum Moment des Abfeuerns ihrer molekularen Maschine brach.
Um dies zu lösen, entwickelte das Team einen neuen Arbeitsablauf, den sie LiFEx nannten, was für Live-to-Fixed Expansion microscopy steht. Dieser Ansatz ermöglichte es ihnen, die Bewegung der Bakterien in Echtzeit zu beobachten, den genauen Moment eines spezifischen Ereignisses aufzuzeichnen und die Probe dann sofort an Ort und Stelle zu fixieren, ohne sie zu bewegen. Sie konnten denselben winzigen Bereich anschließend durch ihr Expansionsprotokoll bearbeiten und ihn erneut unter einem Hochleistungsmikroskop betrachten. Durch den Vergleich des Live-Videos mit dem gedehnten, hochauflösenden Bild konnten sie die Zeitverzögerung zwischen dem Zusammenbau der molekularen Waffe der Bakterien und dem tatsächlichen Aufreißen der Zellmembran messen. Sie fanden heraus, dass die Membran nicht sofort brach; stattdessen dauerte es mehrere Minuten, bis der strukturelle Schaden nach dem Abfeuern ihres Systems sichtbar wurde.
Diese Arbeit liefert ein klareres Bild davon, wie intrazelluläre Pathogene ihre Umgebung navigieren. Die Forscher zeigten, dass die bakterielle Zellwand zwar ein Faktor ist, aber nicht das einzige Hindernis darstellt, um diese winzigen Strukturen klar zu sehen, und dass die chemischen Bedingungen, die zur Konservierung der Probe verwendet werden, eine große Rolle für die Qualität des fertigen Bildes spielen. Viel wichtiger noch: Durch die Kombination von Live-Beobachtung mit hochauflösender Strukturanalyse enthüllten sie die präzise zeitliche Abfolge, wie diese Bakterien die Verteidigung ihrer Wirtszellen durchbrechen. Die Studie behauptet nicht, das Problem der bakteriellen Expansion vollständig gelöst zu haben, da sich die Bakterien immer noch nicht so stark dehnten wie die menschlichen Zellen, aber sie bietet eine robuste Methode, um die dynamischen Interaktionen zwischen Pathogenen und ihren Wirten mit einem Detailgrad zu untersuchen, der zuvor unerreichbar war.
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