Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
Deze studie introduceert een LiFEx-workflow die live-celbeeldvorming correleert met aangepaste expansiemicroscopie om de beperkingen van bacteriële expansie te overwinnen en dynamische gastheer-pathogeeninteracties te onthullen, specifiek door de koppeling van T6SS-5 assemblage aan snelle membraanveranderingen tijdens *Burkholderia thailandensis*-infectie.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Om de onzichtbare machinerie van het leven te kunnen zien, moeten wetenschappers vaak hun instrumenten verkleinen of ze vanaf nul opbouwen. Decennialang werd de grens van wat een lichtmicroscoop kon tonen bepaald door de fysica van het licht zelf; minuscule structuren die kleiner zijn dan een halve golflengte van het licht zouden in elkaar overvloeien, waardoor de complexe details van cellen en de bacteriën die erin leven, verborgen bleven. Expansiemicroscopie ontstond als een slimme omweg voor dit probleem. In plaats van een krachtigere lens te bouwen, vonden onderzoekers een manier om het specimen zelf fysiek uit te rekken. Door een monster in een speciale gel te plaatsen die opzwelt wanneer het in water wordt gedrenkt, kunnen ze de biologische structuren uit elkaar trekken, waardoor ze groter worden en gemakkelijker te zien zijn met standaard microscopen. Deze techniek heeft de manier waarop we de architectuur van cellen bekijken gerevolutioneerd, maar liep tegen een muur aan bij de toepassing op bacteriën. Deze microscopische indringers zijn gehuld in een taaie, beschermende schil die zich verzet tegen rekken, waardoor ze vaak klein en vervormd blijven terwijl de omliggende gastheercel wel opzwelt. Het begrijpen van hoe bacteriën bewegen en zich tussen menselijke cellen verspreiden vereist het duidelijk kunnen zien van deze kleine structuren, maar het pantser dat de bacteriën beschermt, houdt hen ook verborgen voor het zicht.
Een team van onderzoekers aan de Universiteit van Basel heeft deze rektechniek nu aangepast om in menselijke cellen te kijken die geïnfecteerd zijn met Burkholderia thailandensis, een bacterie die dient als model voor een gevaarlijker pathogeen. Ze wilden begrijpen hoe deze bacteriën van de ene cel naar de andere bewegen, een proces dat inhoudt dat ze tegen het celmembraan duwen om een brug naar een buurcel te vormen. De uitdaging was dat terwijl de menselijke cellen in hun experimenten bijna negen keer hun oorspronkelijke grootte aannamen, de bacteriën in hen weigerden mee te rekken, waardoor ze gekrompen en ongelijkmatig bleven. De onderzoekers gingen op zoek naar de reden waarom de bacteriën de expansie tegenwerkten en ontwikkelden een manier om wat ze zagen in de uitgerekte, bevroren monsters te koppelen aan de levende, bewegende gebeurtenissen die vlak daarvoor plaatsvonden.
Het team pakte eerst de vraag aan wat de bacteriën tegenhield. Ze vermoedden dat de bacteriële celwand, een rigide netwerk van suiker en eiwit dat als een schild fungeert, de boosdoener zou kunnen zijn. In hun experimenten probeerden ze deze wand te verwijderen met behulp van enzymen voordat ze het monster uitrekten. Verrassend genoeg zorgde het verwijderen van de wand er niet voor dat de bacteriën volledig expandeerden; ze bleven nog steeds kleiner dan de omliggende menselijke cellen. Ze testten ook of het buitenmembraan van de bacteriën te strak zat of dat de eiwitten binnenin te dicht op elkaar gepakt waren om rek toe te staan. Zelfs toen ze sterkere enzymen gebruikten om de eiwitten te verteren of chemicaliën om het buitenmembraan te versoepelen, rekten de bacteriën nog steeds niet uniform uit. De enige factor die een significant verschil leek te maken, was hoe de cellen werden bewaard voordat het experiment begon. De onderzoekers ontdekten dat de specifieke mengeling van chemicaliën die gebruikt werd om de cellen te fixeren — essentieel om ze op hun plaats te bevriezen — bepaalde of de bacteriën gelijkmatig zouden uitrekken of vervormd zouden blijven. Deze ontdekking suggereert dat de manier waarop wetenschappers hun monsters voorbereiden even cruciaal is als het rekproces zelf.
Ondanks dat de bacteriën niet perfect uitrekten, stelde de nieuwe methode het team in staat om details van de infectie te zien die voorheen onmogelijk te resolveren waren. Ze observeerden hoe de bacteriën tegen het menselijke celmembraan duwden om lange, dunne uitstulpingen te crekken die naar naburige cellen reiken. In sommige gevallen waren deze uitstulpingen glad en continu, maar in andere gevallen leek het membraan gebroken of gefragmenteerd. De onderzoekers konden zien dat de bacteriën een gespecialiseerde moleculaire machine gebruikten, bekend als een secretiesysteem, om gaten in deze membranen te prikken en zo te ontsnappen naar de volgende cel. Omdat de standaardmethode echter slechts een statische opname laat zien nadat het monster is gefixeerd, konden ze niet precies zien wanneer het membraan brak ten opzichte van het moment dat de bacteriën hun moleculaire machine afvuurden.
Om dit op te lossen, ontwikkelde het team een nieuwe workflow die ze LiFEx noemden, wat staat voor Live-to-Fixed Expansion microscopy. Deze benadering stelde hen in staat om de bacteriën in real time te volgen, het exacte moment vast te leggen waarop een specifieke gebeurtenis plaatsvond, en het monster vervolgens onmiddellijk op zijn plaats te fixeren zonder het te verplaatsen. Ze konden datzelfde kleine gebied vervolgens door hun expansieprotocol leiden en het opnieuw bekijken onder een krachtige microscoop. Door de live video te vergelijken met de uitgerekte, hoogresolutie afbeelding, konden ze de tijdvertraging meten tussen het assembleren van het moleculaire wapen door de bacterie en de daadwerkelijke breuk van het celmembraan. Ze ontdekten dat het membraan niet direct brak; het duurde enkele minuten voordat de structurele schade zichtbaar werd nadat de bacteriën hun systeem hadden afgevuurd.
Dit werk biedt een duidelijker beeld van hoe intracellulaire pathogenen hun omgeving navigeren. De onderzoekers toonden aan dat hoewel de bacteriële celwand een factor is, het niet de enige barrière is om deze kleine structuren duidelijk te zien, en dat de chemische condities die worden gebruikt om het monster te bewaren een grote rol spelen in de uiteindelijke beeldkwaliteit. Belangrijker nog, door live observatie te combineren met hoogresolutie structurele analyse, onthulden ze de precieze timing van hoe deze bacteriën de verdediging van hun gastcellen doorbreken. De studie beweert niet het probleem van bacteriële expansie volledig te hebben opgelend, aangezien de bacteriën nog steeds niet zo veel uitrekten als de menselijke cellen, maar het biedt een robuuste methode om de dynamische interacties tussen pathogenen en hun gastheren te bestuderen met een detailniveau dat voorheen onbereikbaar was.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.