Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
本研究引入了一种 LiFEx 工作流，通过将活细胞成像与改进的膨胀显微技术相结合，以克服细菌膨胀的局限性并揭示动态的宿主-病原体相互作用，具体将 T6SS-5 的组装与布雷维拉菌（*Burkholderia thailandensis*）感染期间的快速膜变化联系起来。
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为了观察生命中那些肉眼不可见的微观机制，科学家们经常不得不缩小工具的尺寸，或者从零开始构建它们。几十年来，光学显微镜所能展示的极限一直受限于光本身的物理特性；小于半个光波长的微小结构会模糊在一起，从而掩盖了细胞及其内部生存细菌的复杂细节。膨胀显微技术（Expansion microscopy）作为解决这一问题的巧妙变通方法应运而生。研究人员并没有制造更强大的透镜，而是找到了一种物理性拉伸样本本身的方法。通过将样本嵌入一种在浸泡在水中时会膨胀的特殊凝胶中，他们可以拉开生物结构，使其变得更大，从而更容易用标准显微镜观察。这项技术彻底改变了我们观察细胞架构的方式，但在应用于细菌时却遇到了障碍。这些微小的入侵者包裹在坚硬且具有保护性的外壳中，这种外壳能够抵抗拉伸，往往导致它们在周围宿主细胞膨胀的同时，自身仍保持细小且发生畸变。理解细菌如何在人类细胞之间移动和传播需要清晰地观察这些微小结构，然而正是保护细菌的那层“盔甲”，也让它们隐匿于视线之外。
巴塞尔大学的一个研究小组现在已经改进了这种拉伸技术，用以窥探被“布雷克氏种内热拟单胞菌”（Burkholderia thailandensis）感染的人类细胞，这种细菌是研究一种更危险病原体的模型。他们想要了解这些细菌是如何在细胞间移动的，这一过程涉及向细胞膜施压，从而在邻近细胞中形成一个桥梁。挑战在于，尽管实验中的人类细胞几乎膨胀到了原始尺寸的九倍，但其中的细菌却拒绝像周围细胞那样拉伸，始终保持着缩小的且不均匀的状态。研究人员致力于查明细菌为何产生这种抗性，并开发出一种方法，将他们在拉伸后的冻结样本中所观察到的现象，与发生在前一刻的活体移动事件联系起来。
团队首先解决了是什么在阻碍细菌拉伸的问题。他们怀疑细菌细胞壁——一种由糖和蛋白质组成的、起屏蔽作用的坚硬网格——可能是罪魁祸首。在实验中，他们尝试在拉伸样本前利用酶去除这层细胞壁。令人惊讶的是，去除细胞壁并未使细菌实现充分膨胀；它们仍然比周围的人类细胞要小。他们还测试了是否是细菌的外膜过于紧密，或者是内部蛋白质排列过于密集从而阻碍了拉伸。即便使用了更强的酶来消化蛋白质，或使用化学物质来松动外膜，细菌依然无法实现均匀拉伸。唯一显示出显著差异的因素是细胞在实验开始前的保存方式。研究人员发现，用于固定细胞（本质上是将其“冻结”在原位）的特定化学混合物，决定了细菌是会均匀拉伸还是保持畸变。这一发现表明，科学家准备样本的方式与拉伸过程本身同样至关重要。
尽管细菌未能实现完美的拉伸，但这种新方法仍让团队得以观察到此前无法解析的感染细节。他们观察到细菌正推挤人类细胞膜，以创造出延伸至相邻细胞的长而细的突起。在某些情况下，这些突起是平滑且连续的，但在另一些情况下，细胞膜则显得破碎或断裂。研究人员可以看到，细菌正在利用一种被称为“分泌系统”的专门分子机器，在这些膜上打洞，从而逃逸到下一个细胞中。然而，由于标准方法只能展示样本固定后的静态快照，他们无法准确判断膜破裂的时间点相对于细菌发射其分子机器的时刻究竟是在何时。
为了解决这个问题，该团队开发了一种名为 LiFEx 的新工作流，即“活体到固定膨胀显微技术”（Live-to-Fixed Expansion microscopy）。这种方法让他们能够实时观察细菌的移动，记录下特定事件发生的精确时刻，然后立即在不移动样本的情况下将其固定。随后，他们可以将该微小区域通过膨胀方案进行处理，并在高倍显微镜下再次观察。通过对比实时视频与拉伸后的高分辨率图像，他们可以测量出细菌组装其分子武器与细胞膜实际破裂之间的时间差。他们发现，膜并不会在细菌发射系统后立即破裂；相反，在结构性损伤变得可见之前，需要经过数分钟的时间。
这项工作为理解胞内病原体如何穿梭于其环境提供了更清晰的图景。研究人员证明，虽然细菌细胞壁是一个因素，但它并不是阻碍清晰观察这些微小结构的唯一障碍，且用于保存样本的化学条件在最终成像质量中起到了重要作用。更重要的是，通过结合活体观察与高分辨率结构分析，他们揭示了这些细菌突破宿主细胞防御机制的精确时机。该研究并未声称已完全解决了细菌膨胀的问题，因为细菌确实仍未像人类细胞那样充分拉伸，但它提供了一种稳健的方法，能够以以往难以企及的细节水平，研究病原体与宿主之间的动态相互作用。
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