Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
本研究は、細菌の膨張における制限を克服し、ホスト・病原体相互作用の動態を明らかにするために、ライブセルイメージングと改良型エクスパンション顕微鏡法を相関させたLiFExワークフローを紹介するものであり、具体的には、Burkholderia thailandensis感染時におけるT6SS-5の集合と急速な膜変化との関連性を提示するものである。
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生命の目に見えない仕組みを見るために、科学者たちはしばしば道具を小型化するか、あるいはゼロから作り上げる必要がある。数十年の間、光学顕微鏡で何が見えるかの限界は、光そのものの物理学によって定められてきた。光の波長の半分よりも小さい微細な構造は、ぼやけてしまい、細胞やその中に生息する細菌の複雑な詳細を隠してしまうのである。拡張顕微鏡法（Expansion microscopy）は、この問題に対する巧妙な回避策として登場した。より強力なレンズを作る代わりに、研究者たちは試料そのものを物理的に引き伸ばす方法を見出したのである。水分に浸すと膨張する特殊なゲルの中に試料を埋め込むことで、生物学的構造を引き離し、標準的な顕微鏡でも見やすいように大きくすることができる。この技術は細胞の構造の捉え方に革命をもたらしたが、細菌に適用しようとすると壁に突き当たった。これらの微小な侵入者たちは、引き伸ばしに抵抗する強固で保護的な殻に包まれており、周囲の宿主細胞が膨張する一方で、細菌自体は小さく歪んだまま残ってしまうことが多いのである。細菌がどのようにヒト細胞間を移動し拡散するかを理解するには、これら微小な構造を鮮明に見る必要があるが、細菌を保護しているまさにその装甲が、彼らを視界から隠してしまうのである。
バーゼル大学の研究チームは、より危険な病原体のモデルとなる細菌であるBurkilleria thailandensisに感染したヒト細胞の内部を覗き見るために、この引き伸ばし技術を適応させた。彼らは、これらの細菌がどのようにして細胞から別の細胞へと移動するのか、つまり、隣の細胞へと橋渡しを作るために細胞膜を押し広げるプロセスを理解したいと考えていた。課題は、実験で使用したヒト細胞が元のサイズのほぼ9倍にまで膨張した一方で、中の細菌はそれほど伸びず、縮んだまま不均一な状態であったことである。研究者たちは、なぜ細菌が膨張に抵抗しているのかを解明し、引き伸ばされ、凍結された試料で見えるものと、その直前まで起こっていた生きた動きのある出来事とを結びつける方法を開発することに取り組んだ。
チームはまず、何が細菌の動きを妨げているのかという問いに取り組んだ。彼らは、細菌の細胞壁（盾として機能する糖とタンパク質の硬いメッシュ）が原因ではないかと疑った。実験の中で、彼らは試料を引き伸ばす前に酵素を用いてこの壁を取り除くことを試みた。驚いたことに、壁を取り除いても細菌は十分に膨張せず、依然として周囲のヒト細胞よりも小さく留まった。彼らはまた、細菌の外膜が固すぎるのか、あるいは内部のタンパク質が密集しすぎていて引き伸ばしを妨げているのかもテストした。タンパク質を分解するために強力な酵素を使用したり、外膜を緩めるために化学物質を用いたりしても、細菌は一様に伸びなかった。唯一、有意な差を生じさせた要因は、実験を開始する前に細胞をどのように保存したかであった。研究者たちは、細胞を固定するために使用される特定の化学混合物（本質的には細胞をその場に凍結させるためのもの）が、細菌が均一に膨張するか、あるいは歪んだままになるかを決定することを突き止めた。この発見は、試料の準備方法が、引き伸ばしのプロセス自体と同じくらい重要であることを示唆している。
細菌は完璧には膨張しなかったものの、この新しい手法によって、チームは以前は解像できなかった感染の詳細を観察することができた。彼らは、細菌がヒトの細胞膜を押し、隣の細胞へと到達する長く細い突起を作り出す様子を観察した。これらの突起は滑らかで連続している場合もあれば、膜が壊れたり断片化したりしている場合もあった。研究者たちは、細菌が「分泌系」として知られる特殊な分子機械を使用して、これらの膜に穴を開け、次の細胞へと脱出していることを確認できた。しかし、標準的な手法では、試料を固定した後の静止したスナップショットしか示せないため、細菌が分子機械を放った瞬間に対して、膜がいつ破壊されたのかを正確に特定することはできなかった。
これを解決するために、チームはLiFEx（Live-to-Fixed Expansion microscopy：生細胞から固定への拡張顕微鏡法）と呼ばれる新しいワークフローを開発した。このアプローチにより、細菌が動く様子をリアルタイムで観察し、特定のイベントが発生した正確な瞬間を記録し、その後、その場所を動かさずに直ちに試料を固定することが可能となった。その後、同じ微小領域を拡張プロトコルに通して処理し、高倍率の顕微鏡で再び観察することができる。生細胞のビデオと、引き伸ばされた高解像度の画像を比較することで、細菌が分子兵器を組み立ててから、実際に細胞膜が破裂するまでの時間差を測定することができた。その結果、膜は即座に壊れるのではなく、細菌がシステムを作動させてから構造的な損傷が目に見えるようになるまでには数分間の時間を要することが判明した。
この研究は、細胞内病原体がどのようにその環境をナビゲートしているかについて、より明確な全体像を提供している。研究者たちは、細菌の細胞壁が要因の一つではあるものの、これら微小な構造を鮮明に見るための唯一の障壁ではないこと、そして試料を保存するために使用される化学的条件が最終的な画像の品質に大きな役割を果たすことを示した。より重要なことに、生体観察と高解像度の構造解析を組み合わせることで、これらの細菌が宿主細胞の防御を突破する際の正確なタイミングを明らかにした。この研究は、細菌の膨張に関する問題を完全に解決したと主張するものではない。細菌は依然としてヒト細胞ほどは膨張しなかったからである。しかし、この研究は、これまで到達不可能であったレベルの詳細さをもって、病原体と宿主の間の動的な相互作用を研究するための堅牢な手法を提示している。
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