Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
Questo studio introduce un flusso di lavoro LiFEx che correla l'imaging in cellule vive con la microscopia di espansione adattata per superare i limiti di espansione batterica e rivelare le interazioni dinamiche ospite-patogeno, collegando specificamente l'assemblaggio di T6SS-5 a rapidi cambiamenti di membrana durante l'infezione da *Burkholderia thailandensis*.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Per vedere l'invisibile ingranaggio della vita, gli scienziati devono spesso rimpicciolire i propri strumenti o costruirli da zero. Per decenni, il limite di ciò che un microscopio ottico poteva mostrare è stato stabilito dalla fisica stessa della luce; strutture minuscole più piccole di metà lunghezza d'onda della luce tendevano a sfocarsi insieme, nascondendo i dettagli intricati delle cellule e dei batteri che vivono al loro interno. La microscopia a espansione è emersa come un astuto aggiramento di questo problema. Invece di costruire una lente più potente, i ricercatori hanno trovato un modo per distendere fisicamente il campione stesso. Incorporando un campione in un gel speciale che si gonfia quando viene immerso in acqua, possono separare le strutture biologiche, rendendole più grandi e più facili da vedere con i microscopi standard. Questa tecnica ha rivoluzionato il modo in cui osserviamo l'architettura delle cellule, ma si è scontrata con un muro quando applicata ai batteri. Questi invasori microscopici sono avvolti in un guscio protettivo resistente che resiste all'espansione, causando spesso il fatto che rimangano piccoli e distorti mentre la cellula ospite circostante si gonfia. Comprendere come i batteri si muovano e si diffondano tra le cellule umane richiede di vedere chiaramente queste strutture minuscole, eppure l'armatura stessa che protegge i batteri li nasconde alla vista.
Un team di ricercatori dell'Università di Basilea ha ora adattato questa tecnica di espansione per guardare dentro le cellule umane infettate da Burkholderia thailandensis, un batterio che funge da modello per un patogeno più pericoloso. Volevano capire come questi batteri si muovano da una cellula all'altra, un processo che comporta la pressione contro la membrana cellulare per formare un ponte verso una vicina. La sfida era che, mentre le cellule umane nei loro esperimenti si espandevano quasi nove volte la loro dimensione originale, i batteri al loro interno rifiutavano di distendersi, rimanendo rimpiccioliti e irregolari. I ricercatori si sono posti l'obiettivo di capire perché i batteri stessero resistendo all'espansione e di sviluppare un modo per collegare ciò che vedevano nei campioni distesi e congelati agli eventi vivi e in movimento accaduti solo pochi istanti prima.
Il team ha affrontato prima la questione di cosa stesse trattenendo i batteri. Sospettavano che la parete cellulare batterica, una rigida rete di zucchero e proteine che funge da scudo, potesse essere la colpevole. Nei loro esperimenti, hanno provato a rimuovere questa parete utilizzando enzimi prima di tendere il campione. Sorprendentemente, la rimozione della parete non ha fatto sì che i batteri si espandessero completamente; rimanevano ancora più piccoli rispetto alle cellule umane circostanti. Hanno anche testato se la membrana esterna dei batteri fosse troppo stretta o se le proteine interne fossero troppo densamente impacchettate per permettere l'espansione. Anche quando hanno utilizzato enzimi più forti per digerire le proteine o sostanze chimiche per allentare la membrana esterna, i batteri non si sono comunque distesi in modo uniforme. L'unico fattore che sembrava fare una differenza significativa era come le cellule venivano preservate prima dell'inizio dell'esperimento. I ricercatori hanno scoperto che la specifica miscela di sostanze chimiche utilizzata per fissare le cellule — essenzialmente per congelarle in posizione — determinava se i batteri si sarebbero distesi uniformemente o sarebbero rimasti distorti. Questa scoperta suggerisce che il modo in cui gli scienziati preparano i loro campioni è critico quanto il processo di espansione stesso.
Nonostante i batteri non si distendessero perfettamente, il nuovo metodo ha permesso al team di vedere dettagli dell'infezione che prima erano impossibili da risolvere. Hanno osservato i batteri che premevano contro la membrana cellulare umana per creare protrusioni lunghe e sottili che raggiungono le cellule vicine. In alcuni casi, queste protrusioni erano lide e continue, ma in altri, la membrana appariva rotta o frammentata. I ricercatori potevano vedere che i batteri stavano usando una macchina molecolare specializzata, nota come sistema di secrezione, per perforare queste membrane ed evadere nella cella successiva. Tuttavia, poiché il metodo standard mostra solo un'istantanea statica dopo che il campione è stato fissato, non potevano dire esattamente quando la membrana si rompesse rispetto al momento in cui il batterio sparava la sua macchina molecolare.
Per risolvere questo problema, il team ha sviluppato un nuovo flusso di lavoro chiamato LiFEx, che sta per Live-to-Fixed Expansion microscopy (microscopia a espansione dal vivo al fissato). Questo approccio ha permesso loro di guardare i batteri muoversi in tempo reale, registrare l'istante esatto in cui si verificava un evento specifico e poi fissare immediatamente il campione in posizione senza spostarlo. Potevano quindi sottoporre quella stessa minuscola area al loro protocollo di espansione e osservarla nuovamente sotto un microscopio ad alta potenza. Confrontando il video dal vivo con l'immagine ad alta risoluzione distesa, potevano misurare il ritardo temporale tra l'assemblaggio dell'arma molecolare del batterio e la rottura effettiva della membrana cellulare. Hanno scoperto che la membrana non si rompeva istantaneamente; invece, occorrevano diversi minuti affinché il danno strutturale diventasse visibile dopo che il batterio aveva attivato il suo sistema.
Questo lavoro fornisce un quadro più chiaro di come i patogeni intracellulari navighino nel loro ambiente. I ricercatori hanno dimostrato che, sebbene la parete cellulare batterica sia un fattore, non è l'unico ostacolo per vedere chiaramente queste strutture minuscole, e che le condizioni chimiche utilizzate per preservare il campione giocano un ruolo fondamentale nella qualità finale dell'immagine. Ancora più importante, combinando l'osservazione dal vivo con l'analisi strutturale ad alta risoluzione, hanno rivelato la tempistica precisa di come questi batteri violino le difese delle loro cellule ospiti. Lo studio non sostiene di aver risolto interamente il problema dell'espansione batterica, poiché i batteri non si sono comunque distesi quanto le cellule umane, ma offre un metodo robusto per studiare le interazioni dinamiche tra patogeni e ospiti con un livello di dettaglio che precedentemente era fuori portata.
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