Correlation of Live Imaging and Fixed-Expansion Microscopy to study intracellular pathogens
본 연구는 박테리아 팽창의 한계를 극복하고 *Burkholderia thailandensis* 감염 중 T6SS-5 조립과 급격한 막 변화 사이의 연관성을 밝히기 위해, 살아있는 세포 이미징과 변형된 팽창 현미경 기술을 결합한 LiFEx 워크플로우를 소개한다.
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생명의 보이지 않는 기계 장치를 보기 위해, 과학자들은 종종 도구를 축소하거나 처음부터 직접 만들어내야 한다. 수십 년 동안 광학 현미경이 보여줄 수 있는 한계는 빛의 물리적 특성에 의해 결정되었다. 빛의 파장 절반보다 작은 미세한 구조물들은 서로 뭉쳐져 흐릿하게 보였고, 이로 인해 세포와 그 안에 살고 있는 박테리아의 복잡한 세부 사항들은 숨겨지곤 했다. 확장 현미경법(Expansion microscopy)은 이 문제에 대한 영리한 해결책으로 등장했다. 더 강력한 렌즈를 만드는 대신, 연구자들은 시료 자체를 물리적으로 늘리는 방법을 찾아냈다. 물에 적시면 부풀어 오르는 특수한 겔에 샘플을 심음으로써, 그들은 생물학적 구조를 양옆으로 잡아당겨 표준 현미경으로도 더 크고 쉽게 볼 수 있게 만들었다. 이 기술은 우리가 세포의 구조를 보는 방식을 혁신적으로 바꾸어 놓았지만, 박테리아에 적용될 때는 한계에 부딪혔다. 이 미세한 침입자들은 신축에 저항하는 단단하고 보호적인 껍질에 싸여 있어, 주변의 숙주 세포가 부풀어 오르는 동안에도 박테리아는 종종 작고 왜곡된 상태로 남아 있게 된다. 박테리아가 어떻게 움직이고 인간 세포 사이를 이동하는지 이해하려면 이러한 미세 구조를 명확하게 보는 것이 필요하지만, 박테리아를 보호하는 바로 그 갑옷이 역설적으로 박테리아를 시야로부터 숨겨버린다.
바젤 대학교의 연구팀은 이제 이 확장 기술을 변형하여, 더 위험한 병원균의 모델 역할을 하는 박테리아인 Burkholderia thailandensis에 감염된 인간 세포 내부를 들여다보는 데 성공했다. 그들은 이 박테리아들이 어떻게 한 세포에서 다른 세포로 이동하는지를 이해하고자 했으며, 이 과정은 이웃한 세포로 향하는 다리를 만들기 위해 세포막을 밀어내는 과정을 포함한다. 과제는 실험 중인 인간 세포는 원래 크기의 거의 9배까지 팽창했지만, 그 안의 박테리아는 충분히 늘어나지 않고 작고 불균일한 상태로 남아 있었다는 점이었다. 연구진은 왜 박테리아가 팽창에 저항하는지 밝혀내고, 늘어나서 고정된 샘플에서 관찰한 것을 실제 살아 움직이는 사건 직전의 모습과 연결할 방법을 개발하기 위해 연구에 착수했다.
연구팀은 먼저 무엇이 박테리아를 붙잡고 있는지에 대한 의문을 해결했다. 그들은 당과 단백질로 이루어진 견고한 그물망이자 방패 역할을 하는 박테리아의 세포벽이 원인일 것이라고 의심했다. 실험에서 그들은 샘플을 늘리기 전에 효소를 사용하여 이 벽을 제거해 보았다. 놀랍게도, 세포벽을 제거해도 박테리아는 완전히 팽창하지 않았으며, 여전히 주변의 인간 세포보다 작게 유지되었다. 또한 그들은 박테리아의 외막이 너무 팽팽한 것인지, 혹은 내부의 단백질이 너무 빽빽하게 채워져 있어 팽창을 방해하는 것인지도 테스트했다. 단백질을 분해하는 더 강한 효소를 사용하거나 외막을 느슨하게 하는 화학 물질을 사용했을 때조차, 박테리아는 균일하게 늘어나지 않았다. 유일하게 유의미한 차이를 만든 요인은 실험 시작 전 세포를 어떻게 보존했느냐였다. 연구진은 세포를 고정하는 데 사용된 특정 화학 혼합물이 박테리아를 균일하게 늘릴지, 아니면 왜곡된 상태로 남길지를 결정한다는 사실을 발견했다. 이 발견은 과학자들이 샘플을 준비하는 방식이 팽창 과정 그 자체만큼이나 중요하다는 것을 시사한다.
박테리아가 완벽하게 늘어나지는 않았음에도 불구하고, 이 새로운 방법은 연구팀이 이전에는 해상할 수 없었던 감염의 세부 사항을 관찰할 수 있게 해주었다. 그들은 박테리아가 인간 세포막을 밀어내어 이웃 세포로 뻗어 나가는 길고 가는 돌기(protrusions)를 만드는 것을 관찰했다. 어떤 경우에는 이 돌기들이 매끄럽고 연속적이었지만, 다른 경우에는 막이 깨지거나 파편화된 것처럼 보이기도 했다. 연구진은 박테리아가 분비 시스템(secretion system)이라고 알려진 특화된 분자 기계를 사용하여 이 막에 구멍을 뚫고 다음 세포로 탈출한다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 표준적인 방법은 샘플이 고정된 후의 정적인 스냅샷만을 보여주기 때문에, 박테리아가 분자 기계를 발사한 순간과 관련하여 막이 정확히 언제 파손되었는지는 알 수 없었다.
이를 해결하기 위해 연구팀은 'LiFEx(Live-to-Fixed Expansion microscopy, 생체에서 고정된 상태의 확장 현미경법)'라고 불리는 새로운 워크플로우를 개발했다. 이 접근 방식은 박테리아가 움직이는 것을 실시간으로 관찰하고, 특정 사건이 발생하는 정확한 순간을 기록한 뒤, 샘플을 움직이지 않고 즉시 고정하는 것을 가능하게 했다. 그 후 그 동일한 미세 영역을 확장 프로토콜을 통해 처리하여 고성능 현미경으로 다시 관찰할 수 있었다. 이들은 라이브 비디오와 늘어난 고해상도 이미지를 비교함으로써, 박테리아가 분자 무기를 조립한 시점과 실제 세포막이 파열되는 시점 사이의 시간 지연을 측정할 수 있었다. 그 결과, 막은 즉시 파손되는 것이 아니라, 박테리아가 시스템을 발사한 후 구조적 손상이 눈에 보이게 되기까지 몇 분의 시간이 걸린다는 것을 발견했다.
이 연구는 세포 내 병원균이 자신들의 환경을 어떻게 탐색하는지에 대한 더 명확한 그림을 제공한다. 연구진은 박테리아의 세포벽이 하나의 요인이기는 하지만, 이 작은 구조들을 명확히 보는 데 있어 유일한 장벽은 아니며, 샘플을 보존하는 데 사용되는 화학적 조건이 최종 이미지 품질에 큰 역할을 한다는 것을 입증했다. 더 중요한 것은, 실시간 관찰과 고해상도 구조 분석을 결합함으로써, 이 박테리아들이 숙주의 방어 체계를 어떻게 뚫고 들어가는지에 대한 정확한 타이밍을 밝혀냈다는 점이다. 이 연구는 박테리아의 팽창 문제를 완전히 해결했다고 주장하는 것은 아니다. 박테리아가 여전히 인간 세포만큼 늘어나지는 않았기 때문이다. 하지만 이 연구는 이전에 도달할 수 없었던 수준의 상세함으로 병원균과 숙주 사이의 역동적인 상호작용을 연구할 수 있는 강력한 방법을 제시하고 있다.
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